Alzheimerjevi bolezni (AD) manjkajo beljakovinski biomarkerji, ki odražajo njeno večplastno osnovno patofiziologijo, kar ovira napredek diagnoze in zdravljenja. Tukaj uporabljamo celovito proteomiko za identifikacijo biomarkerjev cerebrospinalne tekočine (CSF), ki predstavljajo širok spekter patofiziologije AD. Multipleksna masna spektrometrija je identificirala približno 3.500 in približno 12.000 proteinov v AD CSF in možganih. Mrežna analiza možganskega proteoma je razrešila 44 modulov biotske raznovrstnosti, od katerih se jih je 15 prekrivalo s proteomom cerebrospinalne tekočine. CSF AD markerji v teh prekrivajočih se modulih so zloženi v pet beljakovinskih skupin, ki predstavljajo različne patofiziološke procese. Sinapse in metaboliti v možganih AD se zmanjšajo, vendar se cerebrospinalna tekočina poveča, medtem ko se mielinizacija, bogata z glijo, in imunske skupine v možganih in cerebrospinalni tekočini povečajo. Doslednost in specifičnost bolezni plošče sprememb sta bili potrjeni v več kot 500 dodatnih vzorcih CSF. Te skupine so identificirale tudi biološke podskupine pri asimptomatskem AD. Na splošno so ti rezultati obetaven korak k spletnim orodjem za biomarkerje za klinične aplikacije pri AD.
Alzheimerjeva bolezen (AD) je najpogostejši vzrok nevrodegenerativne demence po vsem svetu in je značilna široka paleta disfunkcij bioloških sistemov, vključno s sinaptičnim prenosom, glialno posredovano imunostjo in mitohondrijskim metabolizmom (1-3). Vendar pa se njegovi uveljavljeni proteinski biomarkerji še vedno osredotočajo na odkrivanje amiloida in tau proteina in zato ne morejo odražati te raznolike patofiziologije. Ti "jedrni" proteinski biomarkerji, ki se najbolj zanesljivo merijo v cerebrospinalni tekočini (CSF), vključujejo (i) amiloidni beta peptid 1-42 (Aβ1-42), ki odraža nastanek kortikalnih amiloidnih plakov; (ii) totalni tau, znak degeneracije aksona; (iii) fosfo-tau (p-tau), predstavnik patološke hiperfosforilacije tau (4-7). Čeprav so ti biomarkerji cerebrospinalne tekočine močno olajšali naše odkrivanje »označenih« beljakovinskih bolezni AD (4-7), predstavljajo le majhen del kompleksne biologije v ozadju bolezni.
Pomanjkanje patofiziološke raznolikosti biomarkerjev AD je povzročilo številne izzive, vključno z (i) nezmožnostjo prepoznavanja in kvantifikacije biološke heterogenosti bolnikov z AD, (ii) nezadostnim merjenjem resnosti in napredovanja bolezni, zlasti v predklinični fazi, in ( iii) razvoj terapevtskih zdravil, ki niso uspela popolnoma rešiti vseh vidikov nevrološkega poslabšanja. Naše zanašanje na prelomno patologijo za opisovanje AD zaradi sorodnih bolezni le še poslabša te težave. Vse več dokazov kaže, da ima večina starejših ljudi z demenco več kot eno patološko značilnost kognitivnega upada (8). Kar 90 % ali več posameznikov s patologijo AD ima tudi žilno bolezen, vključke TDP-43 ali druge degenerativne bolezni (9). Ti visoki deleži patološkega prekrivanja so zmotili naš trenutni diagnostični okvir za demenco, zato je potrebna celovitejša patofiziološka opredelitev bolezni.
Glede na nujno potrebo po različnih biomarkerjih AD, področje vedno bolj sprejema metodo »omics«, ki temelji na celotnem sistemu za odkrivanje biomarkerjev. Združenje Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance je bilo ustanovljeno leta 2014 in je v ospredju programa. Cilj tega multidisciplinarnega prizadevanja Nacionalnih inštitutov za zdravje, akademskih krogov in industrije je uporaba sistemsko temelječih strategij za boljšo opredelitev patofiziologije AD ter razvoj diagnostične analize biotske raznovrstnosti in strategij zdravljenja (10). Kot del tega projekta je mrežna proteomika postala obetavno orodje za napredek sistemskih biomarkerjev v AD. Ta nepristranski pristop, ki temelji na podatkih, organizira kompleksne nize proteomskih podatkov v skupine ali »module« sočasno izraženih proteinov, ki so povezani s specifičnimi tipi celic, organeli in biološkimi funkcijami (11–13). Na možganih AD je bilo izvedenih skoraj 12 z informacijami bogatih mrežnih proteomičnih študij (13-23). Na splošno te analize kažejo, da proteom možganskega omrežja AD ohranja visoko ohranjeno modularno organizacijo v neodvisnih kohortah in več kortikalnih regijah. Poleg tega nekateri od teh modulov kažejo ponovljive spremembe v številčnosti, povezani z AD, v nizih podatkov, kar odraža patofiziologijo več bolezni. Te ugotovitve skupaj kažejo obetavno sidrišče za odkritje proteoma možganskega omrežja kot sistemskega biomarkerja pri AD.
Da bi preoblikovali proteom možganskega omrežja AD v klinično uporabne sistemske biomarkerje, smo združili omrežje, ki izhaja iz možganov, s proteomsko analizo AD CSF. Ta celostni pristop je pripeljal do identifikacije petih obetavnih nizov biomarkerjev cerebrospinalne tekočine, ki so povezani s širokim spektrom možganske patofiziologije, vključno s sinapsami, krvnimi žilami, mielinizacijo, vnetjem in disfunkcijo presnovnih poti. Te plošče biomarkerjev smo uspešno validirali z večkratnimi analizami podvajanja, vključno z več kot 500 vzorci cerebrospinalne tekočine iz različnih nevrodegenerativnih bolezni. Te validacijske analize vključujejo pregled skupinskih tarč v cerebrospinalni tekočini bolnikov z asimptomatskim AD (AsymAD) ali dokazovanje nenormalnega kopičenja amiloida v normalnem kognitivnem okolju. Te analize poudarjajo pomembno biološko heterogenost v populaciji AsymAD in identificirajo panelne označevalce, ki bi lahko podtipizirali posameznike v najzgodnejših fazah bolezni. Na splošno ti rezultati predstavljajo ključni korak pri razvoju orodij za beljakovinske biomarkerje, ki temeljijo na več sistemih in lahko uspešno rešijo številne klinične izzive, s katerimi se sooča AD.
Glavni namen te študije je identificirati nove biomarkerje cerebrospinalne tekočine, ki odražajo različne možganske patofiziologije, ki vodijo do AD. Slika S1 prikazuje našo raziskovalno metodologijo, ki vključuje (i) celovito analizo, ki temelji na predhodnih ugotovitvah AD CSF in mrežnega možganskega proteoma za identifikacijo več biomarkerjev bolezni CSF, povezanih z možgani, in (ii) naknadno replikacijo. Ti biomarkerji so v več neodvisnih cerebrospinalnih tekoče kohorte. Raziskava, usmerjena v odkritje, se je začela z analizo diferencialne ekspresije cerebrospinalne tekočine pri 20 kognitivno normalnih posameznikih in 20 bolnikih z AD v Centru za raziskovanje Alzheimerjeve bolezni Emory Goizueta (ADRC). Diagnoza AD je opredeljena kot pomembna kognitivna okvara ob prisotnosti nizkega Aβ1-42 in povišanih ravni celotnega tau in p-tau v cerebrospinalni tekočini [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA) )]] (Tabela S1A). Kontrola (povprečni MoCA, 26,7 ± 2,2) je imela normalne ravni biomarkerjev CSF.
Za človeško cerebrospinalno tekočino je značilen dinamičen razpon številčnosti beljakovin, v katerem lahko albumin in druge izjemno bogate beljakovine preprečijo odkrivanje zanimivih beljakovin (24). Da bi povečali globino odkrivanja beljakovin, smo pred analizo z masno spektrometrijo (MS) odstranili prvih 14 zelo bogatih beljakovin iz vsakega vzorca cerebrospinalne tekočine (24). Z MS je bilo identificiranih skupno 39.805 peptidov, ki so bili preslikani na 3691 proteomov v 40 vzorcih. Kvantifikacija beljakovin se izvaja z označevanjem z večkratno tandemsko masno oznako (TMT) (18, 25). Da bi razrešili manjkajoče podatke, smo v nadaljnjo analizo vključili le tiste proteine, ki so bili kvantificirani v vsaj 50 % vzorcev in tako končno kvantificirali 2875 proteomov. Zaradi pomembne razlike v skupnih ravneh številčnosti beljakovin je bil kontrolni vzorec statistično obravnavan kot izstopajoči (13) in ni bil vključen v nadaljnjo analizo. Vrednosti številčnosti preostalih 39 vzorcev so bile prilagojene glede na starost, spol in kovarianco serije (13-15, 17, 18, 20, 26).
Z uporabo statistične analize t-testa za ovrednotenje diferencialne ekspresije na naboru regresijskih podatkov je ta analiza identificirala beljakovine, katerih stopnje številčnosti so bile znatno spremenjene (P <0,05) med kontrolnimi primeri in primeri AD (tabela S2A). Kot je prikazano na sliki 1A, se je številčnost skupno 225 beljakovin v AD znatno zmanjšala, številčnost 303 beljakovin pa se je znatno povečala. Ti različno izraženi proteini vključujejo več predhodno identificiranih markerjev AD v cerebrospinalni tekočini, kot so z mikrotubulami povezani protein tau (MAPT; P = 3,52 × 10-8), nevrofilament (NEFL; P = 6,56 × 10-3), z rastjo povezan protein 43 (GAP43; P = 1,46 × 10–5), beljakovina, ki veže maščobne kisline 3 (FABP3; P = 2,00 × 10–5), hitinaza 3 kot 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10–6), nevronski granulin (NRGN; P = 3,43 × 10-4) in VGF živčni rastni faktor (VGF; P = 4,83 × 10-3) (4-6). Vendar smo identificirali tudi druge zelo pomembne tarče, kot je zaviralec disociacije GDP 1 (GDI1; P = 1,54 × 10-10) in s SPARC povezano modularno vezavo kalcija 1 (SMOC1; P = 6,93 × 10-9) . Gene Ontology (GO) analiza 225 znatno zmanjšanih beljakovin je razkrila tesne povezave s procesi telesnih tekočin, kot so metabolizem steroidov, strjevanje krvi in hormonska aktivnost (slika 1B in tabela S2B). V nasprotju s tem pa je bistveno povečana količina beljakovin 303 tesno povezana s celično strukturo in presnovo energije.
(A) Graf vulkana prikazuje kratno spremembo log2 (x-os) glede na -log10 statistično vrednost P (y-os), pridobljeno s t-testom, ki se uporablja za odkrivanje diferencialne ekspresije med kontrolo (CT) in AD primeri CSF proteoma vseh proteinov. Beljakovine s pomembno znižanimi ravnmi (P <0,05) pri AD so prikazane modro, medtem ko so beljakovine z znatno povečanimi ravnmi pri bolezni prikazane rdeče. Izbrani protein je označen. (B) Najvišji izrazi GO, povezani z beljakovinami, so znatno zmanjšani (modri) in povečani (rdeči) pri AD. Prikazuje tri izraze GO z najvišjimi z-rezultati na področju bioloških procesov, molekularnih funkcij in celičnih komponent. (C) MS izmerjena raven MAPT v vzorcu cerebrospinalne tekočine (levo) in njena korelacija z ravnijo tau vzorca ELISA (desno). Prikaže se Pearsonov korelacijski koeficient z ustrezno vrednostjo P. Zaradi pomanjkanja podatkov ELISA za en primer AD te številke vključujejo vrednosti za 38 od 39 analiziranih primerov. (D) Nadzorovana analiza grozdov (P <0,0001, Benjamini-Hochberg (BH) prilagojen P <0,01) na kontroli in AD CSF je odkrila vzorce z uporabo 65 najbolj pomembno spremenjenih proteinov v nizu podatkov. Standardiziraj, normaliziraj.
Proteomska raven MAPT je tesno povezana z neodvisno izmerjeno raven tau ELISA (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; slika 1C), kar podpira veljavnost naše meritve MS. Po razgradnji tripsina na ravni amiloidnega prekurzorskega proteina (APP) peptidov, specifičnih za izoformo, ki so preslikani na C-terminal Aβ1-40 in Aβ1-42, ni mogoče učinkovito ionizirati (27, 28). Zato peptidi APP, ki smo jih identificirali, nimajo nobene zveze z nivoji ELISA Aβ1-42. Da bi ocenili diferencialno izražanje vsakega primera, smo uporabili diferencialno izražene proteine s P <0,0001 [stopnja napačnega odkritja (FDR) popravljena P <0,01] za izvedbo nadzorovane analize grozdov vzorcev (tabela S2A). Kot je prikazano na sliki 1D, lahko teh 65 zelo pomembnih proteinov pravilno združi vzorce glede na stanje bolezni, razen enega primera AD z lastnostmi, podobnimi kontroli. Od teh 65 proteinov se je 63 povečalo pri AD, medtem ko sta se le dva (CD74 in ISLR) zmanjšala. Skupno so te analize cerebrospinalne tekočine identificirale na stotine beljakovin v AD, ki lahko služijo kot biomarkerji bolezni.
Nato smo izvedli neodvisno mrežno analizo možganskega proteoma AD. Kohorta možganov tega odkritja je vključevala dorzolateralni prefrontalni korteks (DLPFC) iz kontrolnih (n = 10), primerov Parkinsonove bolezni (PD; n = 10), mešanih primerov AD/PD (n = 10) in AD (n = 10). ) Vzorec. Emery Goizueta ADRC. Demografski podatki teh 40 primerov so bili predhodno opisani (25) in so povzeti v tabeli S1B. Uporabili smo TMT-MS za analizo teh 40 možganskih tkiv in replikacijsko kohorto 27 primerov. Skupaj sta ta dva niza podatkov o možganih proizvedla 227.121 edinstvenih peptidov, ki so bili preslikani na 12.943 proteomov (25). V nadaljnje preiskave so bile vključene samo tiste beljakovine, ki so bile kvantificirane v vsaj 50 % primerov. Končni niz podatkov o odkritju vsebuje 8817 kvantificiranih beljakovin. Prilagodite ravni številčnosti beljakovin glede na starost, spol in posmrtni interval (PMI). Analiza diferencialne ekspresije nabora podatkov po regresiji je pokazala, da je bilo >2000 ravni beljakovin pomembno spremenjenih [P <0,05, analiza variance (ANOVA)] v dveh ali več kohortah bolezni. Nato smo izvedli nadzorovano analizo grozdov na podlagi različno izraženih proteinov in P <0,0001 v primerjavah AD/kontrola in/ali AD/PD (slika S2, A in B, tabela S2C). Teh 165 močno spremenjenih proteinov jasno prikazuje primere s patologijo AD iz kontrolnih vzorcev in vzorcev PD, kar potrjuje močne spremembe, specifične za AD, v celotnem proteomu.
Nato smo uporabili algoritem, imenovan Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA), da izvedemo mrežno analizo na odkritem možganskem proteomu, ki organizira nabor podatkov v proteinske module s podobnimi vzorci izražanja (11-13). Analiza je identificirala 44 modulov (M) soizraženih proteinov, razvrščenih in oštevilčenih od največjega (M1, n = 1821 proteinov) do najmanjšega (M44, n = 34 proteinov) (slika 2A in tabela S2D)). Kot je navedeno zgoraj (13) Izračunajte reprezentativni ekspresijski profil ali značilno beljakovino vsakega modula in ga povežite z bolezenskim stanjem in patologijo AD, to je vzpostavite zvezo registra Alzheimerjeve bolezni (CERAD) in Braakove ocene (slika 2B). Na splošno je bilo 17 modulov pomembno povezanih z nevropatologijo AD (P <0,05). Mnogi od teh modulov, povezanih z boleznijo, so tudi bogati z markerji, specifičnimi za vrsto celic (slika 2B). Kot je navedeno zgoraj (13), se obogatitev celičnega tipa določi z analizo prekrivanja modulov in referenčnega seznama genov, specifičnih za tip celice. Ti geni izhajajo iz objavljenih podatkov v izoliranih mišjih nevronih, endotelijskih in glialnih celicah. Poskus sekvenciranja RNA (RNA-seq) (29).
(A) Odkrijte WGCNA možganskega proteoma. (B) Analiza srednje korelacije z dvojno težo (BiCor) modularnega podpisnega proteina (prva glavna komponenta izražanja modularnega proteina) z nevropatološkimi značilnostmi AD (zgoraj), vključno z rezultati CERAD (Aβ plak) in Braak (tau tangles). Intenzivnosti pozitivnih (rdeča) in negativnih (modra) korelacije so prikazane z dvobarvno toplotno karto, zvezdice pa označujejo statistično pomembnost (P <0,05). Uporabite Hipergeometrični Fisherjev natančen test (FET) (spodaj), da ocenite povezavo tipa celice vsakega proteinskega modula. Intenzivnost rdečega senčenja označuje stopnjo obogatitve tipa celice, zvezdica pa označuje statistično pomembnost (P <0,05). Uporabite metodo BH, da popravite vrednost P, pridobljeno iz FET. (C) GO analiza modularnih proteinov. Za vsak modul ali povezano skupino modulov so prikazani najtesneje povezani biološki procesi. oligo, oligodendrocit.
Niz petih tesno povezanih modulov, bogatih z astrociti in mikroglijo (M30, M29, M18, M24 in M5), je pokazal močno pozitivno korelacijo z nevropatologijo AD (slika 2B). Ontološka analiza povezuje te glialne module s celično rastjo, proliferacijo in imunostjo (slika 2C in tabela S2E). Dva dodatna glialna modula, M8 in M22, sta prav tako močno povečana pri bolezni. M8 je zelo povezan s potjo receptorjev, podobnim Tollu, signalno kaskado, ki ima ključno vlogo pri prirojenem imunskem odzivu (30). Hkrati je M22 tesno povezan s posttranslacijsko modifikacijo. M2, ki je bogat z oligodendrociti, kaže močno pozitivno korelacijo s patologijo AD in ontološko povezavo s sintezo nukleozidov in replikacijo DNA, kar kaže na povečano celično proliferacijo pri boleznih. Na splošno te ugotovitve podpirajo dvig glialnih modulov, ki smo jih prej opazili v proteomu mreže AD (13, 17). Trenutno je ugotovljeno, da številni glialni moduli, povezani z AD, v omrežju kažejo nižje ravni izražanja v kontrolnih primerih in primerih PD, kar poudarja njihovo specifičnost bolezni, ki je pri AD povišana (slika S2C).
Samo štirje moduli v našem mrežnem proteomu (M1, M3, M10 in M32) so močno negativno povezani s patologijo AD (P <0,05) (slika 2, B in C). Tako M1 kot M3 sta bogata z nevronskimi markerji. M1 je zelo povezan s sinaptičnimi signali, medtem ko je M3 tesno povezan z mitohondrijsko funkcijo. Ni dokazov o obogatitvi vrste celic za M10 in M32. M32 odraža povezavo med M3 in celičnim metabolizmom, medtem ko je M10 zelo povezan z rastjo celic in delovanjem mikrotubulov. V primerjavi z AD so vsi štirje moduli povečani pri nadzoru in PD, kar jim daje za bolezen specifične spremembe AD (slika S2C). Na splošno ti rezultati podpirajo zmanjšano številčnost modulov, bogatih z nevroni, ki smo jih prej opazili pri AD (13, 17). Če povzamemo, mrežna analiza možganskega proteoma, ki smo jo odkrili, je proizvedla AD-specifično spremenjene module, skladne z našimi prejšnjimi ugotovitvami.
Za AD je značilna zgodnja asimptomatska stopnja (AsymAD), v kateri posamezniki kažejo kopičenje amiloida brez kliničnega kognitivnega upada (5, 31). Ta asimptomatska stopnja predstavlja kritično okno za zgodnje odkrivanje in posredovanje. Prej smo dokazali močno modularno ohranitev proteoma možganskega omrežja AsymAD in AD v neodvisnih nizih podatkov (13, 17). Da bi zagotovili, da je možgansko omrežje, ki smo ga trenutno odkrili, skladno s temi prejšnjimi ugotovitvami, smo analizirali ohranitev 44 modulov v ponovljenem nizu podatkov iz 27 organizacij DLPFC. Te organizacije vključujejo kontrolne (n = 10), primere AsymAD (n = 8) in AD (n = 9). Kontrolni vzorci in vzorci AD so bili vključeni v analizo naše odkrite možganske kohorte (tabela S1B), medtem ko so bili primeri AsymAD edinstveni le v replikacijski kohorti. Tudi ti primeri AsymAD so prišli iz možganske banke Emory Goizueta ADRC. Čeprav je bila kognicija v času smrti normalna, so bile ravni amiloida nenormalno visoke (povprečje CERAD, 2,8 ± 0,5) (tabela S1B).
TMT-MS analiza teh 27 možganskih tkiv je privedla do kvantifikacije 11.244 proteomov. To končno število vključuje samo tiste beljakovine, kvantificirane v vsaj 50 % vzorcev. Ta ponovljeni nabor podatkov vsebuje 8638 (98,0 %) od 8817 proteinov, odkritih v naši odkriti analizi možganov, in ima skoraj 3000 pomembno spremenjenih proteinov med kontrolno in AD kohorto (P <0,05, po Tukeyjevem parnem t testu za analizo variance) ( Tabela S2F). Med temi diferencialno izraženimi proteini je 910 pokazalo tudi pomembne spremembe ravni med AD in primeri nadzora možganskega proteoma (P <0,05, po ANOVA Tukey parnem t-testu). Omeniti velja, da je teh 910 markerjev zelo konsistentnih v smeri spremembe med proteomi (r = 0,94, P <1,0 × 10-200) (slika S3A). Med povečanimi proteini so proteini z najbolj doslednimi spremembami med nizi podatkov v glavnem člani modulov M5 in M18, bogatih z glijo (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 in GFAP). Med zmanjšanimi proteini so bili tisti z najbolj doslednimi spremembami skoraj izključno člani modula M1 (NPTX2, VGF in RPH3A), povezanega s sinapso. Nadalje smo preverili z AD povezane spremembe midkina (MDK), CD44, izločenega proteina 1 (SFRP1) in VGF z western blottingom (slika S3B). Analiza ohranjenosti modulov je pokazala, da je bilo približno 80 % proteinskih modulov (34/44) v možganskem proteomu znatno ohranjenih v naboru podatkov za replikacijo (z-rezultat > 1,96, FDR popravljen P <0,05) (slika S3C). Štirinajst teh modulov je bilo posebej rezerviranih med obema proteomoma (z-rezultat> 10, FDR popravljen P <1,0 × 10-23). Na splošno odkritje in replikacija visoke stopnje doslednosti v diferencialni ekspresiji in modularni sestavi med možganskim proteomom poudarja ponovljivost sprememb v proteinih čelne skorje AD. Poleg tega je tudi potrdilo, da imajo AsymAD in naprednejše bolezni zelo podobno strukturo možganskega omrežja.
Podrobnejša analiza diferencialne ekspresije v nizu podatkov o replikaciji možganov poudarja pomembno stopnjo sprememb beljakovin AsymAD, vključno s skupno 151 bistveno spremenjenimi beljakovinami med AsymAD in kontrolo (P <0,05) (slika S3D). V skladu z amiloidno obremenitvijo se je APP v možganih AsymAD in AD znatno povečal. MAPT se bistveno spremeni le pri AD, kar je skladno s povečanimi stopnjami zapletov in njegovo znano korelacijo s kognitivnim upadom (5, 7). Moduli, bogati z glijo (M5 in M18), se močno odražajo v povečanih beljakovinah v AsymAD, medtem ko je modul M1, povezan z nevroni, najbolj reprezentativen od zmanjšanih beljakovin v AsymAD. Mnogi od teh markerjev AsymAD kažejo večje spremembe pri simptomatskih boleznih. Med temi markerji je SMOC1, glialni protein, ki pripada M18, ki je povezan z možganskimi tumorji ter razvojem oči in udov (32). MDK je rastni faktor, ki veže heparin, povezan s celično rastjo in angiogenezo (33), še en član M18. V primerjavi s kontrolno skupino se je AsymAD znatno povečal, čemur je sledilo večje povečanje AD. V nasprotju s tem je bil sinaptični protein nevropentraksin 2 (NPTX2) znatno zmanjšan v možganih AsymAD. NPTX2 je bil prej povezan z nevrodegeneracijo in ima priznano vlogo pri posredovanju ekscitatornih sinaps (34). Na splošno ti rezultati razkrivajo različne predklinične spremembe beljakovin pri AD, za katere se zdi, da napredujejo z resnostjo bolezni.
Glede na to, da smo pri odkritju možganskega proteoma dosegli pomembno globino pokritosti z beljakovinami, poskušamo bolje razumeti njegovo prekrivanje s transkriptomom AD na ravni omrežja. Zato smo možganski proteom, ki smo ga odkrili, primerjali z modulom, ki smo ga prej ustvarili iz meritev mikromrež 18.204 genov v tkivih AD (n = 308) in kontrolnih (n = 157) DLPFC (13). prekrivajoče se. Skupaj smo identificirali 20 različnih modulov RNA, od katerih so mnogi pokazali obogatitev specifičnih tipov celic, vključno z nevroni, oligodendrociti, astrociti in mikroglijo (slika 3A). Številne spremembe teh modulov v AD so prikazane na sliki 3B. V skladu z našo prejšnjo analizo prekrivanja beljakovin in RNK z uporabo globljega neoznačenega proteoma MS (približno 3000 proteinov) (13) je večina od 44 modulov v omrežju možganskih proteomov, ki smo jih našli, v omrežju transkriptomov. V njem ni pomembnega prekrivanja. naše odkritje in replikacija 34 proteinskih modulov, ki so močno zadržani v možganskem proteomu, je samo 14 (~40 %) opravilo Fisherjev natančen test (FET) dokazano, da se statistično pomembno prekrivajo s transkriptomom (slika 3A). Združljivo s popravljanjem poškodb DNA (P-M25 in P-M19), prevajanjem proteinov (P-M7 in P-M20), vezavo/spajanjem RNA (P-M16 in P-M21) in ciljanjem na beljakovine (P-M13 in P- M23) se ne prekriva z moduli v transkriptomu. Zato, čeprav je v trenutni analizi prekrivanja uporabljen globlji nabor podatkov o proteomih (13), večina proteoma omrežja AD ni preslikana v omrežje transkriptoma.
(A) Hipergeometrični FET prikazuje obogatitev markerjev, specifičnih za tip celice, v modulu RNA transkriptoma AD (zgoraj) in stopnjo prekrivanja med moduloma RNA (os x) in proteinom (os y) možganov AD (spodaj) . Intenzivnost rdečega senčenja označuje stopnjo obogatitve vrst celic na zgornji plošči in intenzivnost prekrivanja modulov na spodnji plošči. Zvezdice označujejo statistično značilnost (P <0,05). (B) Stopnja korelacije med značilnimi geni vsakega modula transkriptoma in statusom AD. Moduli na levi so v najbolj negativni korelaciji z AD (modri), tisti na desni pa v najbolj pozitivni korelaciji z AD (rdeči). Log-transformirana BH-popravljena vrednost P kaže stopnjo statistične pomembnosti vsake korelacije. (C) Znatno prekrivajoči se moduli s skupno obogatitvijo vrste celic. (D) Korelacijska analiza log2-kratne spremembe označenega proteina (x-os) in RNA (y-os) v prekrivajočem se modulu. Prikaže se Pearsonov korelacijski koeficient z ustrezno vrednostjo P. Mikro, mikroglija; nebesna telesa, astrociti. CT, kontrola.
Večina prekrivajočih se proteinskih in RNA modulov ima podobne profile obogatitve celičnega tipa in dosledne smeri spreminjanja AD (slika 3, B in C). Z drugimi besedami, modul M1 možganskega proteoma (PM1), povezan s sinapsami, je preslikan v tri z nevroni bogate homologne RNA module (R-M1, R-M9 in R-M16), ki so v AD. Oba sta pokazala znižana raven. Podobno se proteinski moduli M5 in M18, bogati z glijo, prekrivajo z moduli RNA, bogatimi z astrociti in mikroglialnimi markerji (R-M3, R-M7 in R-M10), in so močno vpleteni v povečanje bolezni. Te skupne modularne funkcije med obema nizoma podatkov nadalje podpirajo obogatitev vrste celic in spremembe, povezane z boleznijo, ki smo jih opazili v možganskem proteomu. Vendar smo opazili veliko pomembnih razlik med nivoji RNA in beljakovin posameznih markerjev v teh skupnih modulih. Korelacijska analiza diferencialne ekspresije proteomike in transkriptomike molekul znotraj teh prekrivajočih se modulov (slika 3D) poudarja to nedoslednost. Na primer, APP in več drugih proteinov glialnega modula (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 in SFRP1) so pokazali znatno povečanje proteoma AD, vendar ni bilo skoraj nobene spremembe v transkriptomu AD. Te beljakovinsko specifične spremembe so lahko tesno povezane z amiloidnimi plaki (23, 35), kar poudarja proteom kot vir patoloških sprememb, te spremembe pa se morda ne odražajo v transkriptomu.
Po neodvisni analizi proteomov možganov in cerebrospinalne tekočine, ki smo jih odkrili, smo izvedli obsežno analizo dveh nizov podatkov, da bi identificirali biomarkerje AD CSF, povezane s patofiziologijo možganskega omrežja. Najprej moramo definirati prekrivanje obeh proteomov. Čeprav je splošno sprejeto, da CSF odraža nevrokemične spremembe v možganih AD (4), natančna stopnja prekrivanja med možgani AD in proteomom CSF ni jasna. S primerjavo števila skupnih genskih produktov, odkritih v naših dveh proteomih, smo ugotovili, da je bilo skoraj 70 % (n = 1936) proteinov, identificiranih v cerebrospinalni tekočini, kvantificiranih tudi v možganih (slika 4A). Večina teh prekrivajočih se proteinov (n = 1721) je preslikanih v enega od 44 modulov koekspresije iz podatkovnega niza odkritih možganov (slika 4B). Kot je bilo pričakovano, je šest največjih možganskih modulov (M1 do M6) pokazalo največjo količino prekrivanja CSF. Vendar pa obstajajo manjši možganski moduli (na primer M15 in M29), ki dosežejo nepričakovano visoko stopnjo prekrivanja, večjo od možganskega modula, ki je dvakrat večji. To nas motivira, da sprejmemo podrobnejšo, statistično vodeno metodo za izračun prekrivanja med možgani in cerebrospinalno tekočino.
(A in B) Proteini, odkriti v naborih podatkov možganov odkrivanja in CSF, se prekrivajo. Večina teh prekrivajočih se proteinov je povezanih z enim od 44 modulov koekspresije mreže možganske koekspresije. (C) Odkrijte prekrivanje med proteomom cerebrospinalne tekočine in proteomom možganske mreže. Vsaka vrstica toplotne karte predstavlja ločeno analizo prekrivanja hipergeometričnega FET. Zgornja vrstica prikazuje prekrivanje (sivo/črno senčenje) med možganskim modulom in celotnim proteomom CSF. Druga vrstica prikazuje, da je prekrivanje med možganskimi moduli in beljakovinami cerebrospinalne tekočine (osenčeno z rdečo) znatno povečano pri AD (P <0,05). Tretja vrstica kaže, da je prekrivanje med možganskimi moduli in beljakovinami cerebrospinalne tekočine (modro senčenje) znatno zmanjšano pri AD (P <0,05). Uporabite metodo BH, da popravite vrednost P, pridobljeno iz FET. (D) Plošča zložljivega modula, ki temelji na povezavi vrste celice in povezanih izrazih GO. Te plošče vsebujejo skupno 271 beljakovin, povezanih z možgani, ki imajo pomembno diferencialno izražanje v proteomu CSF.
Z uporabo enostranskih FET smo ocenili pomembnost prekrivanja beljakovin med proteomom CSF in posameznimi možganskimi moduli. Analiza je pokazala, da ima skupno 14 možganskih modulov v naboru podatkov CSF statistično značilna prekrivanja (FDR prilagojen P <0,05) in dodatni modul (M18), katerega prekrivanje je blizu pomembnosti (FDR prilagojen P = 0,06) (slika 4C). , zgornja vrstica). Zanimajo nas tudi moduli, ki se močno prekrivajo z diferencialno izraženimi proteini CSF. Zato smo uporabili dve dodatni analizi FET, da bi ugotovili, katera od (i) beljakovin CSF je bila znatno povečana pri AD in (ii) beljakovin CSF se je znatno zmanjšala pri AD (P <0,05, parni t test AD/kontrola) Možganski moduli s pomembnim prekrivanjem med njimi. Kot je prikazano v srednji in spodnji vrstici slike 4C, te dodatne analize kažejo, da se 8 od 44 možganskih modulov znatno prekriva z beljakovino, dodano v AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 in M38) . ), medtem ko sta le dva modula (M6 in M15) pokazala pomembno prekrivanje z zmanjšanim proteinom v AD CSF. Kot je bilo pričakovano, je vseh 10 modulov v 15 modulih z največjim prekrivanjem s proteomom CSF. Zato domnevamo, da je teh 15 modulov visoko zmogljiv vir biomarkerjev CSF, pridobljenih iz AD.
Teh 15 prekrivajočih se modulov smo zložili v pet velikih beljakovinskih plošč na podlagi njihove bližine v drevesnem diagramu WGCNA in njihove povezave s tipi celic in gensko ontologijo (slika 4D). Prva plošča vsebuje module, bogate z nevronskimi markerji in proteini, povezanimi s sinapsami (M1 in M12). Sinaptični panel vsebuje skupno 94 proteinov in ravni v proteomu cerebrospinalne tekočine so se znatno spremenile, zaradi česar je med petimi paneli največji vir označevalcev cerebrospinalne tekočine, povezanih z možgani. Druga skupina (M6 in M15) je pokazala tesno povezavo z markerji endotelijskih celic in vaskularnim telesom, kot sta "celjenje ran" (M6) in "regulacija humoralnega imunskega odziva" (M15). M15 je prav tako močno povezan z metabolizmom lipoproteinov, ki je tesno povezan z endotelijem (36). Vaskularna plošča vsebuje 34 markerjev CSF, povezanih z možgani. Tretja skupina vključuje module (M2 in M4), ki so pomembno povezani z oligodendrocitnimi markerji in celično proliferacijo. Na primer, izrazi ontologije na najvišji ravni M2 vključujejo "pozitivno regulacijo replikacije DNA" in "proces biosinteze purina". Medtem tiste iz M4 vključujejo "diferenciacijo glialnih celic" in "ločevanje kromosomov". Mielinizacijska plošča vsebuje 49 markerjev CSF, povezanih z možgani.
Četrta skupina vsebuje največ modulov (M30, M29, M18, M24 in M5), skoraj vsi moduli pa so izrazito bogati z markerji mikroglije in astrocitov. Podobno kot plošča za mielinizacijo tudi četrta plošča vsebuje module (M30, M29 in M18), ki so tesno povezani s celično proliferacijo. Drugi moduli v tej skupini so zelo povezani z imunološkimi izrazi, kot sta »proces imunskega učinka« (M5) in »uravnavanje imunskega odziva« (M24). Glialna imunska skupina vsebuje 42 markerjev CSF, povezanih z možgani. Zadnja plošča vključuje 52 označevalcev, povezanih z možgani, na štirih modulih (M44, M3, M33 in M38), ki so vsi na telesu in so povezani s shranjevanjem energije in presnovo. Največji od teh modulov (M3) je tesno povezan z mitohondriji in je bogat z nevronsko specifičnimi markerji. M38 je eden od manjših članov modula v tem metabolomu in kaže tudi zmerno nevronsko specifičnost.
Na splošno teh pet plošč odraža širok razpon tipov celic in funkcij v skorji AD in skupaj vsebuje 271 označevalcev CSF, povezanih z možgani (tabela S2G). Da bi ovrednotili veljavnost teh rezultatov MS, smo uporabili proximity extension assay (PEA), pravokotno tehnologijo na osnovi protiteles z zmožnostmi multipleksiranja, visoko občutljivostjo in specifičnostjo, ter ponovno analizirali vzorce cerebrospinalne tekočine, ki smo jih našli. Podskupina teh 271 biomarkerjev (n = 36). Teh 36 tarč prikazuje spremembo večkratnika AD za PEA, ki je tesno povezana z našimi ugotovitvami na podlagi MS (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), kar je močno potrdilo rezultate naše celovite analize MS (slika S4). ).
Biološke teme, ki jih poudarja naših pet skupin, od sinaptične signalizacije do energijske presnove, so vse povezane s patogenezo AD (1-3). Zato je vseh 15 modulov, ki vsebujejo te plošče, povezanih s patologijo AD v možganskem proteomu, ki smo jo odkrili (slika 2B). Najbolj opazna je visoka pozitivna patološka korelacija med našimi glialnimi moduli in močna negativna patološka korelacija med našimi največjimi nevronskimi moduli (M1 in M3). Analiza diferencialne ekspresije našega repliciranega možganskega proteoma (slika S3D) prav tako poudarja glialne proteine, pridobljene iz M5 in M18. Pri AsymAD in simptomatskem AD se najbolj povečajo glialni proteini in sinapse, povezane z M1. Protein se najbolj zmanjša. Ta opažanja kažejo, da je 271 markerjev cerebrospinalne tekočine, ki smo jih identificirali v petih skupinah, povezanih z boleznimi v skorji AD, vključno s tistimi, ki se pojavijo v zgodnjih asimptomatskih fazah.
Da bi bolje analizirali smer spreminjanja panelnih proteinov v možganih in hrbtenični tekočini, smo za vsakega od 15 prekrivajočih se modulov narisali naslednje: (i) našli smo raven številčnosti modula v nizu podatkov o možganih in (ii) modul protein Razlika je izražena v cerebrospinalni tekočini (slika S5). Kot smo že omenili, se WGCNA uporablja za določanje številčnosti modula ali značilne vrednosti beljakovin v možganih (13). Zemljevid vulkana se uporablja za opis diferencialne ekspresije modularnih proteinov v cerebrospinalni tekočini (AD/kontrola). Te številke kažejo, da trije od petih plošč kažejo različne trende izražanja v možganih in hrbtenični tekočini. Dva modula plošče sinaps (M1 in M12) kažeta zmanjšanje stopnje številčnosti v možganih AD, vendar se znatno prekrivata s povečano količino beljakovin v CSF AD (slika S5A). Moduli, povezani z nevroni, ki vsebujejo metabolome (M3 in M38), so pokazali, da so podobni vzorci izražanja možganov in cerebrospinalne tekočine nedosledni (slika S5E). Vaskularna plošča je pokazala tudi različne trende izražanja, čeprav so bili njeni moduli (M6 in M15) zmerno povečani v možganih AD in zmanjšani v oboleli CSF (slika S5B). Preostali dve plošči vsebujeta velika glialna omrežja, katerih proteini so dosledno regulirani navzgor v obeh predelih (slika S5, C in D).
Upoštevajte, da ti trendi niso skupni vsem označevalcem na teh podoknih. Na primer, sinaptična plošča vključuje več proteinov, ki so znatno zmanjšani v AD možganih in CSF (slika S5A). Med temi nizko reguliranimi markerji cerebrospinalne tekočine sta NPTX2 in VGF M1 ter kromogranin B M12. Kljub tem izjemam pa je večina naših sinaptičnih markerjev povišanih v hrbtenični tekočini AD. Na splošno je bilo s temi analizami mogoče razločiti statistično pomembne trende ravni možganov in cerebrospinalne tekočine v vsaki od naših petih plošč. Ti trendi poudarjajo zapleteno in pogosto drugačno razmerje med izražanjem beljakovin v možganih in CSF pri AD.
Nato smo uporabili visoko zmogljivo analizo replikacije MS (replikacija CSF 1), da zožimo naš nabor biomarkerjev 271 na najbolj obetavne in ponovljive tarče (slika 5A). CSF kopija 1 vsebuje skupaj 96 vzorcev iz Emory Goizueta ADRC, vključno s kontrolo, AsymAD in kohorto AD (tabela S1A). Za te primere AD je značilen blag kognitivni upad (povprečni MoCA, 20,0 ± 3,8) in spremembe biomarkerjev AD, potrjene v cerebrospinalni tekočini (tabela S1A). V nasprotju z analizo cerebrospinalne tekočine, ki smo jo ugotovili, se ta replikacija izvaja z učinkovitejšo in zmogljivejšo metodo MS »single-shot« (brez frakcioniranja brez povezave), vključno s poenostavljenim protokolom za pripravo vzorcev, ki odpravlja potrebo po oslabitvi imunskega sistema posameznih vzorcev. . Namesto tega se za ojačanje signala manj bogatih proteinov uporablja en sam imunsko osiromašen »kanal za izboljšanje« (37). Čeprav zmanjša celotno pokritost s proteomom, ta metoda z enim posnetkom bistveno skrajša strojni čas in poveča število vzorcev, označenih s TMT, ki jih je mogoče analizirati kot uspešne (17, 38). Skupaj je analiza identificirala 6.487 peptidov, ki so bili preslikani na 1.183 proteomov v 96 primerih. Tako kot pri analizi cerebrospinalne tekočine, ki smo jo ugotovili, so bile v poznejše izračune vključene samo tiste beljakovine, ki so bile kvantificirane v vsaj 50 % vzorcev, podatki pa so bili regresirani za učinke starosti in spola. To je privedlo do končne kvantifikacije 792 proteomov, od katerih je bilo 95 % identificiranih tudi v najdenem nizu podatkov CSF.
(A) Z možgani povezani proteinski cilji cerebrospinalne tekočine, preverjeni v prvi ponovljeni kohorti cerebrospinalne tekočine in vključeni v končno ploščo (n = 60). (B do E) Ravni panelnih biomarkerjev (sestavljeni z-rezultati), izmerjene v štirih kohortah replikacije CSF. Seznanjeni t-testi ali ANOVA s Tukeyjevim naknadnim popravkom so bili uporabljeni za ovrednotenje statistične pomembnosti sprememb številčnosti v vsaki analizi ponovitev. CT, kontrola.
Ker nas še posebej zanima preverjanje naših 271 z možgani povezanih tarč cerebrospinalne tekočine s celovito analizo, bomo omejili nadaljnjo preiskavo tega repliciranega proteoma na te markerje. Med temi 271 proteini je bilo 100 odkritih v replikaciji CSF 1. Slika S6A prikazuje diferencialno izražanje teh 100 prekrivajočih se markerjev med kontrolnimi vzorci in vzorci replikacije AD. Sinaptični in presnovni histoni se najbolj povečajo pri AD, medtem ko se žilni proteini najbolj zmanjšajo pri bolezni. Večina od 100 prekrivajočih se markerjev (n = 70) je ohranila isto smer spremembe v dveh nizih podatkov (slika S6B). Teh 70 potrjenih z možgani povezanih označevalcev cerebrospinalne tekočine (tabela S2H) v veliki meri odraža prej opažene trende izražanja panelov, to je znižanje regulacije žilnih proteinov in povečanje vseh drugih panelov. Samo 10 od teh 70 validiranih proteinov je pokazalo spremembe v številčnosti AD, ki so bile v nasprotju s temi panelnimi trendi. Da bi ustvarili ploščo, ki najbolje odraža splošni trend možganov in cerebrospinalne tekočine, smo teh 10 proteinov izključili iz zanimive plošče, ki smo jo končno preverili (slika 5A). Zato naša plošča na koncu vključuje skupno 60 beljakovin, preverjenih v dveh neodvisnih kohortah CSF AD z uporabo različnih priprav vzorcev in analize platforme MS. Grafi z-rezultatov izražanja teh končnih plošč v kontrolnih primerih kopije 1 CSF in AD so potrdili trend plošče, opažen v kohorti CSF, ki smo jo našli (slika 5B).
Med temi 60 proteini so molekule, za katere je znano, da so povezane z AD, kot je osteopontin (SPP1), ki je provnetni citokin, ki je bil povezan z AD v številnih študijah (39-41), in GAP43, sinaptični protein ki je jasno povezana z nevrodegeneracijo (42). Najbolj popolnoma preverjeni proteini so markerji, povezani z drugimi nevrodegenerativnimi boleznimi, kot sta superoksid dismutaza 1 (SOD1) povezana z amiotrofično lateralno sklerozo (ALS) in desaharaza povezana s Parkinsonovo boleznijo (PARK7). Preverili smo tudi, da so številni drugi markerji, kot sta SMOC1 in signalni protein 1 za pritrditev membrane, bogat z možgani (BASP1), omejili prejšnje povezave z nevrodegeneracijo. Treba je omeniti, da zaradi njihove majhne skupne abundance v proteomu cerebrospinalne tekočine težko uporabimo to visoko zmogljivo metodo zaznavanja z enim posnetkom za zanesljivo odkrivanje MAPT in nekaterih drugih beljakovin, povezanih z AD (na primer NEFL in NRGN). ) (43, 44).
Nato smo preverili teh 60 označevalcev prednostnih plošč v treh dodatnih analizah ponovitev. V kopiji CSF 2 smo uporabili en sam TMT-MS za analizo neodvisne skupine 297 kontrolnih vzorcev in vzorcev AD iz Emory Goizueta ADRC (17). Replikacija likvorja 3 je vključevala ponovno analizo razpoložljivih podatkov TMT-MS 120 kontrolnih bolnikov in bolnikov z AD iz Lausanne v Švici (45). Zaznali smo več kot dve tretjini od 60 prednostnih označevalcev v vsakem nizu podatkov. Čeprav je švicarska študija uporabila različne platforme MS in metode kvantifikacije TMT (45, 46), smo v dveh ponovljenih analizah močno reproducirali naše panelne trende (slika 5, C in D ter tabele S2, I in J). Za ovrednotenje specifičnosti bolezni naše skupine smo uporabili TMT-MS za analizo četrtega nabora podatkov o replikaciji (replikacija cerebrospinalne tekočine 4), ki ni vključevala samo kontrolnih (n = 18) in AD (n = 17) primerov, ampak tudi PD ( n = 14)), vzorcev ALS (n = 18) in frontotemporalne demence (FTD) (n = 11) (tabela S1A). Uspešno smo kvantificirali skoraj dve tretjini panelnih proteinov v tej kohorti (38 od 60). Ti rezultati poudarjajo spremembe, specifične za AD, v vseh petih ploščah biomarkerjev (slika 5E in tabela S2K). Povečanje v skupini metabolitov je pokazalo najmočnejšo specifičnost AD, sledita mielinizacija in glialna skupina. V manjši meri FTD kaže tudi povečanje med temi ploščami, kar lahko odraža podobne morebitne spremembe omrežja (17). V nasprotju s tem sta ALS in PD pokazala skoraj enak profil mielinizacije, glije in metaboloma kot kontrolna skupina. Na splošno kljub razlikam v pripravi vzorcev, platformi MS in metodah kvantifikacije TMT te ponavljajoče se analize kažejo, da imajo naši označevalci prednostnih plošč zelo dosledne spremembe, specifične za AD, v več kot 500 edinstvenih vzorcih CSF.
Nevrodegeneracija AD je bila splošno priznana nekaj let pred pojavom kognitivnih simptomov, zato obstaja nujna potreba po biomarkerjih AsymAD (5, 31). Vendar vse več dokazov kaže, da biologija AsymAD še zdaleč ni homogena in da kompleksna interakcija tveganja in odpornosti vodi do velikih individualnih razlik v kasnejšem napredovanju bolezni (47). Čeprav se uporabljajo za identifikacijo primerov AsymAD, ravni osnovnih biomarkerjev cerebrospinalne tekočine (Aβ1-42, skupni tau in p-tau) niso dokazale, da bi lahko zanesljivo napovedale, kdo bo napredoval do demence (4, 7), kar kaže na več. je potrebno vključiti celostna orodja za biomarkerje, ki temeljijo na številnih vidikih fiziologije možganov, da bi natančno stratificirali tveganje te populacije. Zato smo naknadno analizirali našo ploščo biomarkerjev, potrjeno z AD, v populaciji AsymAD kopije 1 CSF. Teh 31 primerov AsymAD je pokazalo nenormalne ravni osnovnih biomarkerjev (razmerje Aβ1–42/celotni tau ELISA, <5,5) in popolno kognicijo (povprečni MoCA, 27,1 ± 2,2) (tabela S1A). Poleg tega imajo vsi posamezniki z AsymAD klinično oceno demence 0, kar kaže, da ni dokazov o poslabšanju dnevne kognitivne ali funkcionalne zmogljivosti.
Najprej smo analizirali ravni validiranih panelov v vseh 96 ponovitvah CSF 1, vključno s kohorto AsymAD. Ugotovili smo, da je imelo več panelov v skupini AsymAD pomembne spremembe številčnosti, podobne AD, vaskularni panel je pokazal trend padanja v AsymAD, medtem ko so vsi drugi paneli pokazali trend naraščanja (slika 6A). Zato so vse plošče pokazale zelo pomembno korelacijo z ELISA Aβ1-42 in skupnimi ravnmi tau (slika 6B). Nasprotno pa je korelacija med skupino in oceno MoCA razmeroma slaba. Ena izmed bolj osupljivih ugotovitev teh analiz je velik razpon številčnosti plošč v kohorti AsymAD. Kot je prikazano na sliki 6A, raven plošče skupine AsymAD običajno prečka raven plošče kontrolne skupine in skupine AD, kar kaže relativno visoko variabilnost. Za nadaljnje raziskovanje te heterogenosti AsymAD smo uporabili analizo večdimenzionalnega skaliranja (MDS) za 96 primerov replikacije 1 CSF. Analiza MDS omogoča vizualizacijo podobnosti med primeri na podlagi določenih spremenljivk v naboru podatkov. Za to analizo grozdov uporabljamo le tiste potrjene označevalce plošče, ki imajo statistično pomembno spremembo (P <0,05, AD/kontrola) na ravni proteoma 1 za odkrivanje in replikacijo CSF (n = 29) (tabela S2L). Ta analiza je ustvarila jasno prostorsko združevanje med našo kontrolo in primeri AD (slika 6C). V nasprotju s tem so nekateri primeri AsymAD jasno združeni v kontrolni skupini, drugi pa se nahajajo v primerih AD. Za nadaljnje raziskovanje te heterogenosti AsymAD smo uporabili naš zemljevid MDS za opredelitev dveh skupin teh primerov AsymAD. Prva skupina je vključevala primere AsymAD, združene bližje kontroli (n = 19), medtem ko so za drugo skupino značilni primeri AsymAD s profilom markerjev, ki je bližje AD (n = 12).
(A) Raven izražanja (z-rezultat) skupine biomarkerjev CSF v vseh 96 vzorcih v kohorti replikacije 1 CSF, vključno z AsymAD. Analiza variance s Tukeyjevim naknadnim popravkom je bila uporabljena za oceno statistične pomembnosti sprememb številčnosti plošč. (B) Korelacijska analiza ravni številčnosti panelnih beljakovin (z-rezultat) z oceno MoCA in skupno ravnijo tau v vzorcih ELISA Aβ1-42 in CSF kopije 1. Prikaže se Pearsonov korelacijski koeficient z ustrezno vrednostjo P. (C) MDS 96 primerov CSF kopije 1 je temeljil na stopnjah številčnosti 29 potrjenih panelnih označevalcev, ki so bili bistveno spremenjeni v podatkovnih nizih odkritja in CSF kopije 1 [P <0,05 AD/kontrola (CT)]. Ta analiza je bila uporabljena za razdelitev skupine AsymAD na kontrolno (n = 19) in AD (n = 12) podskupini. (D) Graf vulkana prikazuje diferencialno izražanje vseh proteinov replikacije 1 CSF z log2-kratno spremembo (os x) glede na -log10 statistično vrednost P med obema podskupinama AsymAD. Panelni biomarkerji so obarvani. (E) Stopnja številčnosti replikacije CSF 1 biomarkerjev izbirne skupine je različno izražena med podskupinami AsymAD. Za oceno statistične pomembnosti je bila uporabljena Tukeyeva post-prilagojena analiza variance.
Preučili smo diferencialno izražanje beljakovin med temi kontrolnimi primeri in primeri AsymAD, podobnimi AD (slika 6D in tabela S2L). Nastali zemljevid vulkana kaže, da se je 14 oznak plošč med obema skupinama bistveno spremenilo. Večina teh markerjev je članov sinapse in metaboloma. Vendar SOD1 in substrat proteinske kinaze C, bogat z miristoiliranim alaninom (MARCKS), ki sta člana mielinske oziroma glialne imunske skupine, prav tako spadata v to skupino (slika 6, D in E). Žilni panel je prispeval tudi dva markerja, ki sta bila znatno zmanjšana v skupini AsymAD, podobni AD, vključno z AE vezavnim proteinom 1 (AEBP1) in članom družine komplementa C9. Pri ELISA AB1-42 (P = 0,38) in p-tau (P = 0,28) ni bilo pomembne razlike med kontrolno in AD-podobno podskupino AsymAD, vendar je bila res pomembna razlika v skupni ravni tau (P = 0,0031 ) (slika S7). Obstaja več oznak na plošči, ki kažejo, da so spremembe med obema podskupinama AsymAD pomembnejše od skupnih ravni tau (na primer YWHAZ, SOD1 in MDH1) (slika 6E). Na splošno ti rezultati kažejo, da lahko naša validirana plošča vsebuje biomarkerje, ki lahko podvrstijo in potencialno tvegajo stratifikacijo bolnikov z asimptomatsko boleznijo.
Obstaja nujna potreba po sistemskih orodjih za biomarkerje za boljše merjenje in ciljanje različnih patofiziologij, ki stojijo za AD. Pričakuje se, da ta orodja ne bodo le spremenila našega diagnostičnega okvira AD, temveč tudi spodbujala sprejetje učinkovitih strategij zdravljenja, specifičnih za bolnika (1, 2). V ta namen smo uporabili nepristranski celovit proteomski pristop k AD možganom in cerebrospinalni tekočini, da bi identificirali spletne biomarkerje cerebrospinalne tekočine, ki odražajo širok spekter možganske patofiziologije. Naša analiza je ustvarila pet panelov biomarkerjev CSF, ki (i) odražajo sinapse, krvne žile, mielin, imunsko in presnovno disfunkcijo; (ii) dokazati močno ponovljivost na različnih platformah MS; (iii) Pokaži progresivne spremembe, značilne za bolezen, skozi zgodnjo in pozno fazo AD. Na splošno te ugotovitve predstavljajo obetaven korak k razvoju raznolikih, zanesljivih, spletno usmerjenih orodij za biomarkerje za raziskave AD in klinične aplikacije.
Naši rezultati kažejo visoko ohranjeno organizacijo proteoma možganskega omrežja AD in podpirajo njegovo uporabo kot sidro za sistemski razvoj biomarkerjev. Naša analiza kaže, da imata dva neodvisna nabora podatkov TMT-MS, ki vsebujeta možgane AD in AsymAD, močno modularnost. Te ugotovitve razširjajo naše prejšnje delo in dokazujejo ohranitev močnih modulov več kot 2000 možganskih tkiv iz več neodvisnih kohort v frontalni, parietalni in temporalni skorji (17). To soglasno omrežje odraža različne spremembe, povezane z boleznijo, opažene v trenutnih raziskavah, vključno s povečanjem vnetnih modulov, bogatih z glijo, in zmanjšanjem modulov, bogatih z nevroni. Tako kot sedanja raziskava tudi to obsežno omrežje vključuje znatne modularne spremembe v AsymAD, ki prikazujejo različne predklinične patofiziologije (17).
Vendar pa je znotraj tega zelo konzervativnega sistema, ki temelji na sistemu, več natančne biološke heterogenosti, zlasti med posamezniki v zgodnjih fazah AD. Naša plošča biomarkerjev lahko prikaže dve podskupini v AsymAD, ki prikazujeta pomembno diferencialno izražanje več markerjev CSF. Naša skupina je lahko poudarila biološke razlike med tema dvema podskupinama, ki niso bile očitne na ravni osnovnih biomarkerjev AD. V primerjavi s kontrolno skupino so bila razmerja Aβ1-42/skupni tau pri teh posameznikih AsymAD nenormalno nizka. Vendar pa so se med obema podskupinama AsymAD bistveno razlikovale samo skupne ravni tau, medtem ko sta ravni Aβ1-42 in p-tau ostali razmeroma primerljivi. Ker se zdi, da je visok tau cerebrospinalne tekočine boljši napovedovalec kognitivnih simptomov kot ravni Aβ1-42 (7), sumimo, da imata kohorti AsymAD različno tveganje za napredovanje bolezni. Glede na omejeno velikost vzorca našega AsymAD in pomanjkanje longitudinalnih podatkov so potrebne nadaljnje raziskave za zanesljivo pripravo teh zaključkov. Vendar pa ti rezultati kažejo, da lahko sistemska plošča CSF izboljša našo sposobnost učinkovite stratifikacije posameznikov v asimptomatski fazi bolezni.
Naše ugotovitve na splošno podpirajo vlogo več bioloških funkcij v patogenezi AD. Vendar pa je nereguliran energetski metabolizem postal pomembna tema vseh naših petih potrjenih plošč za označevanje. Presnovni proteini, kot sta hipoksantin-gvanin fosforiboziltransferaza 1 (HPRT1) in laktat dehidrogenaza A (LDHA), so najbolj robustno potrjeni sinaptični biomarkerji, kar kaže, da je povečanje AD CSF zelo ponovljiv spol. Naše krvne žile in glialne plošče vsebujejo tudi več markerjev, ki sodelujejo pri presnovi oksidativnih snovi. Te ugotovitve so skladne s ključno vlogo, ki jo imajo presnovni procesi v celotnih možganih, ne le za izpolnjevanje velikega povpraševanja nevronov po energiji, ampak tudi za izpolnjevanje velikega povpraševanja po energiji astrocitov in drugih celic glije (17, 48). Naši rezultati potrjujejo vse več dokazov, da so lahko spremembe v redoks potencialu in prekinitev energijskih poti ključna povezava med več ključnimi procesi, vključenimi v patogenezo AD, vključno z mitohondrijskimi motnjami, vnetjem, ki ga povzroča glia, in poškodbami žil (49). Poleg tega presnovni biomarkerji cerebrospinalne tekočine vsebujejo veliko število različno bogatih beljakovin med našo kontrolno in AD-podobno podskupino AsymAD, kar kaže, da je motnja teh energijskih in redoks poti lahko kritična v predklinični fazi bolezni.
Različni trendi panelov možganov in cerebrospinalne tekočine, ki smo jih opazili, imajo tudi zanimive biološke posledice. Sinapse in metabolomi, bogati z nevroni, kažejo znižane ravni v možganih AD in povečano številčnost v cerebrospinalni tekočini. Glede na to, da so nevroni bogati z mitohondriji, ki proizvajajo energijo v sinapsah, da zagotovijo energijo za svoje številne specializirane signale (50), je pričakovana podobnost profilov izražanja teh dveh skupin nevronov. Izguba nevronov in iztiskanje poškodovanih celic lahko razložita te trende na ploščah možganov in cerebrospinalne tekočine pri poznejših boleznih, ne moreta pa razložiti zgodnjih sprememb na plošči, ki jih opazimo (13). Ena od možnih razlag za te ugotovitve pri zgodnji asimptomatski bolezni je nenormalno sinaptično obrezovanje. Novi dokazi na mišjih modelih kažejo, da se lahko sinaptična fagocitoza, posredovana z mikroglijo, nenormalno aktivira pri AD in povzroči zgodnjo izgubo sinapse v možganih (51). Ta zavrženi sinaptični material se lahko kopiči v cerebrospinalni tekočini, zato opazimo povečanje cerebrospinalne tekočine v nevronski plošči. Imunsko posredovano sinaptično obrezovanje lahko tudi delno pojasni povečanje glialnih proteinov, ki jih opazimo v možganih in cerebrospinalni tekočini v celotnem procesu bolezni. Poleg sinaptičnega obrezovanja lahko splošne nepravilnosti v eksocitni poti povzročijo tudi različne možganske in cerebrospinalne ekspresije nevronskih markerjev. Številne študije so pokazale, da se je vsebnost eksosomov v patogenezi možganske AD spremenila (52). V proliferacijo Aβ je vključena tudi zunajcelična pot (53, 54). Treba je omeniti, da lahko zatiranje eksosomskega izločanja zmanjša patologijo, podobno AD, pri transgenih mišjih modelih AD (55).
Hkrati je beljakovina v vaskularni plošči pokazala zmerno povečanje v AD možganih, vendar se je znatno zmanjšala v CSF. Disfunkcija krvno-možganske pregrade (BBB) lahko delno pojasni te ugotovitve. Številne neodvisne posmrtne študije na ljudeh so pokazale razgradnjo BBB pri AD (56, 57). Te študije so potrdile različne nenormalne dejavnosti, ki obkrožajo to tesno zaprto plast endotelijskih celic, vključno s puščanjem možganskih kapilar in perivaskularnim kopičenjem beljakovin, ki se prenašajo s krvjo (57). To lahko zagotovi preprosto razlago za povišane vaskularne beljakovine v možganih, vendar ne more popolnoma razložiti izčrpavanja teh istih beljakovin v cerebrospinalni tekočini. Ena od možnosti je, da centralni živčni sistem aktivno izolira te molekule, da reši problem povečanega vnetja in oksidativnega stresa. Zmanjšanje nekaterih najresnejših proteinov cerebrospinalne tekočine v tem panelu, zlasti tistih, ki sodelujejo pri regulaciji lipoproteinov, je povezano z zaviranjem škodljivih ravni vnetja in nevroprotektivnega procesa reaktivnih kisikovih vrst. To velja za paroksonazo 1 (PON1), encim, ki veže lipoproteine, odgovoren za zmanjšanje ravni oksidativnega stresa v obtoku (58, 59). Prekurzor alfa-1-mikroglobulina/bikunina (AMBP) je še en bistveno znižano reguliran marker vaskularne skupine. Je predhodnik transporterja lipidov bikunina, ki je prav tako vključen v zatiranje vnetja in nevrološko zaščito (60, 61).
Kljub različnim zanimivim hipotezam je nezmožnost neposrednega odkrivanja biokemičnih mehanizmov bolezni dobro znana omejitev proteomske analize, ki temelji na odkritjih. Zato so potrebne nadaljnje raziskave za zanesljivo opredelitev mehanizmov za temi ploščami biomarkerjev. Da bi se premaknili k razvoju klinične analize, ki temelji na MS, prihodnja usmeritev zahteva tudi uporabo ciljno usmerjenih kvantitativnih metod za obsežno preverjanje biomarkerjev, kot je selektivno ali vzporedno spremljanje reakcije (62). Nedavno smo uporabili spremljanje vzporedne reakcije (63), da bi potrdili številne spremembe beljakovin CSF, ki so opisane tukaj. Več prednostnih ciljnih plošč je kvantificiranih s precejšnjo natančnostjo, vključno z YWHAZ, ALDOA in SMOC1, ki se preslikajo v naše sinapse, metabolizem in vnetne plošče (63). Neodvisno pridobivanje podatkov (DIA) in druge strategije, ki temeljijo na MS, so lahko koristne tudi za preverjanje ciljev. Bud et al. (64) Nedavno je bilo dokazano, da obstaja znatno prekrivanje med biomarkerji AD, opredeljenimi v našem naboru podatkov o odkritju CSF, in neodvisnem naboru podatkov DIA-MS, ki je sestavljen iz skoraj 200 vzorcev CSF iz treh različnih evropskih kohort. Te nedavne študije podpirajo potencial naših panelov za pretvorbo v zanesljivo zaznavanje na podlagi MS. Tradicionalno odkrivanje na osnovi protiteles in aptamerjev je pomembno tudi za nadaljnji razvoj ključnih biomarkerjev AD. Zaradi nizke abundance CSF je te biomarkerje težje odkriti z uporabo visoko zmogljivih MS metod. NEFL in NRGN sta dva taka primera biomarkerjev cerebrospinalne tekočine z majhno številčnostjo, ki sta preslikana na ploščo v naši celoviti analizi, vendar ju ni mogoče zanesljivo zaznati z našo eno samo strategijo MS. Ciljne strategije, ki temeljijo na več protitelesih, kot je PEA, lahko spodbujajo klinično transformacijo teh markerjev.
Na splošno ta študija zagotavlja edinstven proteomski pristop za identifikacijo in preverjanje biomarkerjev CSF AD na podlagi različnih sistemov. Optimiziranje teh označevalnih plošč v dodatnih kohortah AD in platformah MS se lahko izkaže za obetavno za napredovanje stratifikacije tveganja in zdravljenja AD. Študije, ki ocenjujejo longitudinalno raven teh plošč skozi čas, so prav tako ključne za določitev, katera kombinacija markerjev najbolje razsloji tveganje za zgodnjo bolezen in spremembe v resnosti bolezni.
Razen treh vzorcev, ki jih je kopiral CSF, so bili vsi vzorci CSF, uporabljeni v tej študiji, zbrani pod okriljem Emory ADRC ali tesno povezanih raziskovalnih ustanov. V teh študijah proteomike so bili uporabljeni skupno štirje kompleti vzorcev Emory CSF. Ugotovljeno je bilo, da kohorta CSF vsebuje vzorce 20 zdravih kontrol in 20 bolnikov z AD. CSF kopija 1 vključuje vzorce 32 zdravih kontrol, 31 posameznikov AsymAD in 33 posameznikov AD. CSF kopija 2 vsebuje 147 kontrol in 150 vzorcev AD. Kohorta replikacije CSF 4 z več boleznimi je vključevala 18 vzorcev kontrol, 17 AD, 19 ALS, 13 PD in 11 vzorcev FTD. V skladu s sporazumom, ki ga je odobril institucionalni revizijski odbor univerze Emory, so vsi udeleženci študije Emory pridobili informirano soglasje. V skladu s Smernicami najboljših praks Nacionalnega inštituta za staranje za centre za Alzheimerjevo bolezen iz leta 2014 (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html) je bila cerebrospinalna tekočina zbrana in shranjena z lumbalno punkcijo. Kontrolni bolniki ter bolniki z AsymAD in AD so prejeli standardizirano kognitivno oceno na Emory Cognitive Neurology Clinic ali Goizueta ADRC. Njihove vzorce cerebrospinalne tekočine je testiral INNO-BIA AlzBio3 Luminex za ELISA Aβ1-42, skupno analizo tau in p-tau (65). Vrednosti ELISA se uporabljajo za podporo diagnostični klasifikaciji preiskovancev na podlagi uveljavljenih mejnih meril AD biomarkerjev (66, 67). Osnovne demografske in diagnostične podatke za druge diagnoze CSF (FTD, ALS in PD) prav tako pridobite pri Emory ADRC ali pridruženih raziskovalnih ustanovah. Povzetek metapodatkov o primerih za te primere Emory CSF je na voljo v tabeli S1A. Značilnosti švicarske kohorte replikacije CSF 3 so bile že objavljene (45).
CSF je našel vzorec. Da bi povečali globino našega odkritja nabora podatkov CSF, smo pred tripsinizacijo izvedli imunsko porabo beljakovin z visoko vsebnostjo. Skratka, 130 μl cerebrospinalne tekočine iz 40 posameznih vzorcev cerebrospinalne tekočine in enako količino (130 μl) High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) smo dali v vrtilno kolono (Thermo Fisher Scientific, A89868) pri sobni temperatura Inkubacija). Po 15 minutah vrtenja vzorec centrifugirajte 2 minuti pri 1000 g. 3K ultracentrifugalna filtrirna naprava (Millipore, UFC500396) je bila uporabljena za koncentriranje vzorca iztoka s centrifugiranjem pri 14.000 g 30 minut. Vse količine vzorca razredčite na 75 μl s fiziološko raztopino s fosfatnim pufrom. Koncentracijo beljakovin smo ovrednotili z metodo bicinhoninske kisline (BCA) po protokolu proizvajalca (Thermo Fisher Scientific). Imunsko osiromašen CSF (60 μl) iz vseh 40 vzorcev smo razgradili z lizil endopeptidazo (LysC) in tripsinom. Na kratko, vzorec smo reducirali in alkilirali z 1,2 μl 0,5 M tris-2(-karboksietil)-fosfina in 3 μl 0,8 M kloroacetamida pri 90 °C 10 minut, nato pa 15 minut obdelovali z ultrazvokom v vodni kopeli. Vzorec smo razredčili s 193 μl 8 M sečninskega pufra [8 M sečnine in 100 mM NaHPO4 (pH 8,5)] do končne koncentracije 6 M sečnine. LysC (4,5 μg; Wako) se uporablja za razgradnjo čez noč pri sobni temperaturi. Vzorec smo nato razredčili na 1 M sečnino s 50 mM amonijevim bikarbonatom (ABC) (68). Dodajte enako količino (4,5 μg) tripsina (Promega) in nato vzorec inkubirajte 12 ur. Raztopino prebavljenega peptida nakisajte na končno koncentracijo 1 % mravljinčne kisline (FA) in 0,1 % trifluoroocetne kisline (TFA) (66) in nato razsolite s 50 mg kolono Sep-Pak C18 (Waters), kot je opisano zgoraj (25). . Peptid smo nato eluirali v 1 ml 50% acetonitrila (ACN). Za standardizacijo kvantifikacije beljakovin v serijah (25) so bili 100 μl alikvoti iz vseh 40 vzorcev cerebrospinalne tekočine združeni v mešani vzorec, ki je bil nato razdeljen na pet vzorcev globalnega internega standarda (GIS) (48). Vsi posamezni vzorci in kombinirani standardi se posušijo s hitrim vakuumom (Labconco).
CSF kopira vzorec. Dayon in sodelavci so predhodno opisali oslabitev imunskega sistema in prebavo vzorcev kopije 3 CSF (45, 46). Preostali ponovitveni vzorci niso bili individualno oslabljeni. Te neodstranjene vzorce prebavite v tripsinu, kot je opisano prej (17). Za vsako ponovljeno analizo smo 120 μl alikvote eluiranega peptida iz vsakega vzorca združili in razdelili na enake volumske alikvote, ki so bili uporabljeni kot globalni interni standard, označen s TMT (48). Vsi posamezni vzorci in kombinirani standardi se posušijo s hitrim vakuumom (Labconco). Da bi povečali signal proteina cerebrospinalne tekočine z nizko abundanco, smo s kombiniranjem 125 μl iz vsakega vzorca pripravili "izboljšan" vzorec za vsako ponovitveno analizo [tj. biološki vzorec, ki posnema raziskovalni vzorec, vendar je razpoložljiva količina veliko večji (37, 69)] združili v mešani vzorec CSF (17). Mešani vzorec je bil nato imunsko odstranjen z uporabo 12 ml High Select Top14 Abundance Protein Removal Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372), razgrajen, kot je opisano zgoraj, in vključen v naslednje večkratno označevanje s TMT.
Čas objave: 27. avgusta 2021