Hvala, ker ste obiskali Nature.com. Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS. Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju). Da bi zagotovili nadaljnjo podporo, bomo medtem spletno mesto upodobili brez slogov in JavaScripta.
Termofili so mikroorganizmi, ki uspevajo pri visokih temperaturah. Njihovo preučevanje lahko zagotovi dragocene informacije o tem, kako se življenje prilagaja ekstremnim razmeram. Vendar pa je z običajnimi optičnimi mikroskopi težko doseči visoke temperature. Predlaganih je bilo več domačih rešitev, ki temeljijo na lokalnem uporovnem električnem ogrevanju, vendar preproste komercialne rešitve ni. V tem prispevku predstavljamo koncept laserskega segrevanja v mikroskopskem merilu nad vidnim poljem mikroskopa, da zagotovimo visoke temperature za termofilne študije, hkrati pa ohranjamo blago uporabnika. Ogrevanje na mikroskopskem nivoju pri zmerni laserski intenzivnosti je mogoče doseči z uporabo substrata, prevlečenega z zlatimi nanodelci, kot biokompatibilnega in učinkovitega absorberja svetlobe. Obravnavani so možni učinki konvekcije tekočine v mikroskopskem merilu, zadrževanje celic in centrifugalno termoforetično gibanje. Metoda je bila dokazana pri dveh vrstah: (i) Geobacillus stearothermophilus, aktivni termofilni bakteriji, ki se razmnožuje pri približno 65 °C, za katero smo opazili, da kalijo, raste in plava pod segrevanjem v mikroskopskem merilu; (ii) Thiobacillus sp., optimalno hipertermofilna arheja. pri 80°C. To delo utira pot za preprosto in varno opazovanje termofilnih mikroorganizmov z uporabo sodobnih in cenovno dostopnih mikroskopskih orodij.
Skozi milijarde let se je življenje na Zemlji razvilo, da bi se prilagodilo širokemu spektru okoljskih pogojev, ki včasih z našega človeškega vidika veljajo za ekstremne. Zlasti nekateri termofilni mikroorganizmi (bakterije, arheje, glive), imenovani termofili, uspevajo v temperaturnem območju od 45 °C do 122 °C1, 2, 3, 4. Termofili živijo v različnih ekosistemih, kot so globokomorska hidrotermalna vrela, vroči vrelci ali vulkanska območja. Njihove raziskave so v zadnjih nekaj desetletjih vzbudile veliko zanimanja iz vsaj dveh razlogov. Prvič, od njih se lahko na primer naučimo, kako so termofili 5, 6, encimi 7, 8 in membrane 9 stabilni pri tako visokih temperaturah ali kako lahko termofili prenesejo ekstremne ravni sevanja10. Drugič, so osnova za številne pomembne biotehnološke aplikacije1,11,12, kot so proizvodnja goriva13,14,15,16, kemična sinteza (dihidro, alkoholi, metan, aminokisline itd.)17, biorudarjenje18 in termostabilni biokatalizatorji7,11, 13. Zlasti trenutno dobro znana verižna reakcija s polimerazo (PCR)19 vključuje encim (Taq polimerazo), izoliran iz termofilne bakterije Thermus aquaticus, ene prvih odkritih termofilov.
Vendar preučevanje termofilov ni lahka naloga in je ni mogoče improvizirati v nobenem biološkem laboratoriju. Zlasti živih termofilov ni mogoče opazovati in vitro z nobenim standardnim svetlobnim mikroskopom, niti s komercialno dostopnimi grelnimi komorami, ki so običajno ocenjene za temperature do 40 °C. Od devetdesetih let prejšnjega stoletja se je le nekaj raziskovalnih skupin posvetilo uvajanju sistemov visokotemperaturne mikroskopije (HTM). Leta 1994 Glukh et al. Grelna/hladilna komora je bila zasnovana na podlagi uporabe Peltierjeve celice, ki nadzoruje temperaturo pravokotnih kapilar, zaprtih za vzdrževanje anaerobnosti 20 . Napravo je mogoče segreti do 100 °C s hitrostjo 2 °C/s, kar avtorjem omogoča preučevanje gibljivosti hipertermofilne bakterije Thermotoga maritima21. Leta 1999 so Horn et al. Razvita je bila zelo podobna naprava, ki še vedno temelji na uporabi segretih kapilar, primernih za komercialno mikroskopijo za preučevanje celične delitve/povezave. Po dolgem obdobju relativne nedejavnosti se je leta 2012 ponovno začelo iskanje učinkovitih HTM, zlasti v povezavi s serijo člankov skupine Wirth, ki je uporabila napravo, ki so jo izumili Horn et al. Pred petnajstimi leti so preučevali gibljivost velikega števila arhej, vključno s hipertermofili, pri temperaturah do 100 °C z uporabo ogretih kapilar 23, 24. Modificirali so tudi originalni mikroskop, da bi dosegli hitrejše segrevanje (nekaj minut namesto 35 minut, da dosežejo nastavljeno temperaturo) in dosegli linearni temperaturni gradient več kot 2 cm po mediju. Ta naprava za oblikovanje temperaturnega gradienta (TGFD) je bila uporabljena za preučevanje mobilnosti številnih termofilov znotraj temperaturnih gradientov na biološko pomembnih razdaljah 24, 25.
Segrevanje zaprtih kapilar ni edini način za opazovanje živih termofilov. Leta 2012 sta Kuwabara et al. Uporabljene so bile domače Pyrex komore za enkratno uporabo, zatesnjene s toplotno odpornim lepilom (Super X2; Cemedine, Japonska). Vzorci so bili postavljeni na komercialno dostopno prozorno grelno ploščo (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japonska), ki se lahko segreje do 110 °C, vendar prvotno ni bila namenjena biološkemu slikanju. Avtorji so opazili učinkovito delitev anaerobnih termofilnih bakterij (Thermosipho globiformans, čas podvajanja 24 min) pri 65°C. Leta 2020 so Pulshen et al. Učinkovito segrevanje komercialnih kovinskih posod (AttofluorTM, Thermofisher) je bilo prikazano z uporabo dveh domačih grelnih elementov: pokrova in mize (konfiguracija, ki jo je navdihnil PCR stroj). Ta povezava ima za posledico enotno temperaturo tekočine in preprečuje izhlapevanje in kondenzacijo na dnu pokrova. Uporaba O-tesnila preprečuje izmenjavo plinov z okoljem. Ta HTM, imenovan Sulfoscope, je bil uporabljen za slikanje Sulfolobus acidocaldarius pri 75 °C27.
Priznana omejitev vseh teh sistemov je bila omejitev na uporabo zračnih objektivov, pri čemer kakršna koli potopitev v olje ni bila primerna za tako visoko temperaturo in za slikanje skozi > 1 mm debele prozorne vzorce. Priznana omejitev vseh teh sistemov je bila omejitev na uporabo zračnih objektivov, pri čemer kakršna koli potopitev v olje ni bila primerna za tako visoko temperaturo in za slikanje skozi > 1 mm debele prozorne vzorce. Splošno znana pomanjkljivost vseh teh sistemov je bila omejena na uporabo zračnih objektivov, saj vsako potopno vlaganje v olje ni bilo primerno za tako visoko temperaturo in za vizualizacije s prozornimi vzorci debeline > 1 mm. Priznana pomanjkljivost vseh teh sistemov je bila omejitev na uporabo zračnih objektivov, saj morebitna oljna imerzija ni bila primerna za tako visoko temperaturo in za vizualizacijo skozi prozorne vzorce debeline > 1 mm.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合这样的高温和通过> 1毫米厚的透明样品成像。 Priznana omejitev vseh teh sistemov je omejitev uporabe zrcala z vnosom zraka, saj je kakršna koli potopitev v olje neprimerna za slikanje prozornih vzorcev debeline >1 mm pri tako visokih temperaturah. Splošno znana pomanjkljivost vseh teh sistemov je omejena uporaba zračnih objektivov, vsako potopno vlaganje v olje, neprimerno za tako visoke temperature in vizualizacije s prozornimi vzorci debeline >1 mm. Priznana pomanjkljivost vseh teh sistemov je omejena uporaba zračnih leč, morebitna oljna imerzija je neprimerna za tako visoke temperature in vizualizacijo skozi prozorne vzorce debeline >1 mm.Pred kratkim so to omejitev odpravili Charles-Orzag et al. 28, ki je razvil napravo, ki ne zagotavlja več toplote okoli sistema, ki nas zanima, temveč znotraj samega pokrovnega stekla, prekritega s tanko prozorno plastjo upora iz ITO (indij-kositrov oksid). Pokrov se lahko segreje do 75 °C s prehodom električnega toka skozi prozorno plast. Vendar mora avtor lečo objektiva tudi segreti, vendar ne več kot 65 °C, da je ne poškoduje.
Ta dela kažejo, da razvoj učinkovite visokotemperaturne optične mikroskopije ni bil široko sprejet, pogosto zahteva domačo opremo in se pogosto doseže na račun prostorske ločljivosti, kar je resna pomanjkljivost, saj termofilni mikroorganizmi niso večji od nekaj mikrometri. Zmanjšana prostornina segrevanja je ključna za rešitev treh inherentnih težav HTM: slabe prostorske ločljivosti, velike toplotne vztrajnosti, ko se sistem segreje, in škodljivega segrevanja okoliških elementov (potopnega olja, leče objektiva … ali uporabnikovih rok) pri ekstremnih temperaturah. ).
V tem prispevku predstavljamo HTM za termofilno opazovanje, ki ne temelji na uporovnem segrevanju. Namesto tega smo dosegli lokalizirano segrevanje v omejenem območju vidnega polja mikroskopa z laserskim obsevanjem substrata, ki absorbira svetlobo. Porazdelitev temperature je bila vizualizirana s kvantitativno fazno mikroskopijo (QPM). Učinkovitost te metode dokazujeta Geobacillus stearothermophilus, gibljiva termofilna bakterija, ki se razmnožuje pri približno 65 °C in ima kratek čas podvojitve (približno 20 minut), in Sulfolobus shibatae, hipertermofil, ki optimalno raste pri 80 °C (arheje). ponazoriti. Normalno hitrost replikacije in plavanje so opazili kot funkcijo temperature. Ta laserski HTM (LA-HTM) ni omejen z debelino pokrovnega stekelca ali naravo objektiva (potopitev v zrak ali olje). To omogoča uporabo vseh objektivov visoke ločljivosti na trgu. Prav tako ne trpi zaradi počasnega segrevanja zaradi toplotne vztrajnosti (doseže takojšnje segrevanje v milisekundnem obsegu) in uporablja samo komercialno dostopne komponente. Edini novi varnostni pomisleki so povezani s prisotnostjo močnih laserskih žarkov (običajno do 100 mW) znotraj naprave in morda skozi oči, zaradi česar so potrebna zaščitna očala.
Načelo LA-HTM je uporaba laserja za segrevanje vzorca lokalno znotraj vidnega polja mikroskopa (slika 1a). Da bi to naredili, mora vzorec absorbirati svetlobo. Da bi uporabili razumno moč laserja (manj kot 100 mW), se nismo zanašali na absorpcijo svetlobe s tekočim medijem, ampak smo umetno povečali absorpcijo vzorca s prevleko substrata z zlatimi nanodelci (slika 1c). Segrevanje zlatih nanodelcev s svetlobo je temeljnega pomena za področje toplotne plazmonike, s pričakovanimi aplikacijami v biomedicini, nanokemiji ali pridobivanju sončne svetlobe 29, 30, 31. V zadnjih nekaj letih smo ta LA-HTM uporabili v več študijah, povezanih z aplikacijami toplotne plazme v fiziki, kemiji in biologiji. Glavna težava pri tej metodi je prikaz končnega temperaturnega profila, saj je povišana temperatura omejena na območje mikroskale znotraj vzorca. Pokazali smo, da je temperaturno preslikavo mogoče doseči s prečnim strižnim interferometrom s štirimi valovnimi dolžinami, preprosto, visokoločljivo in zelo občutljivo metodo kvantitativne fazne mikroskopije, ki temelji na uporabi dvodimenzionalnih uklonskih rešetk (znanih tudi kot navzkrižne rešetke). 33,34,35,36. Zanesljivost te tehnike toplotne mikroskopije, ki temelji na mikroskopiji valovne fronte s križno rešetko (CGM), je bila prikazana v ducatu člankov, objavljenih v zadnjem desetletju37,38,39,40,41,42,43.
Shema namestitve vzporednega laserskega grelnega, oblikovalnega in temperaturnega mikroskopa. b Geometrija vzorca, sestavljena iz komore AttofluorTM, ki vsebuje pokrovno stekelce, prevlečeno z zlatimi nanodelci. c Pozorno si oglejte vzorec (ne v merilu). d predstavlja enakomeren profil laserskega žarka in (e) simulirano naknadno porazdelitev temperature na ravnini vzorca zlatih nanodelcev. f je krožni profil laserskega žarka, primeren za generiranje enakomerne temperature, kot je prikazano v simulaciji posledične porazdelitve temperature, prikazane v (g). Merilna lestvica: 30 µm.
Zlasti nedavno smo dosegli segrevanje celic sesalcev z LA-HTM in CGM in sledili odzivom celičnega toplotnega šoka v območju 37-42 °C, kar je pokazalo uporabnost te tehnike za slikanje posamezne žive celice. Vendar pa uporaba LA-HTM pri preučevanju mikroorganizmov pri visokih temperaturah ni nedvoumna, saj zahteva večjo previdnost v primerjavi s celicami sesalcev: prvič, segrevanje dna medija za več deset stopinj (namesto nekaj stopinj) povzroči na močan navpični temperaturni gradient. lahko ustvari konvekcijo tekočine 44, ki lahko, če ni trdno pritrjena na podlago, povzroči neželeno gibanje in mešanje bakterij. To konvekcijo je mogoče odpraviti z zmanjšanjem debeline plasti tekočine. V ta namen so bile v vseh spodaj predstavljenih poskusih bakterijske suspenzije postavljene med dve krovni stekelci debeline približno 15 µm, nameščeni v kovinsko skodelico (AttofluorTM, Thermofisher, slika 1b,c). Načeloma se lahko konvekciji izognemo, če je debelina tekočine manjša od velikosti žarka grelnega laserja. Drugič, delo v tako omejeni geometriji lahko zaduši aerobne organizme (glej sliko S2). Tej težavi se je mogoče izogniti z uporabo substrata, ki je prepusten za kisik (ali kateri koli drug vitalni plin), tako da pustite ujete zračne mehurčke znotraj pokrovnega stekelca ali z vrtanjem lukenj v zgornjem pokrovnem stekelcu (glejte sliko S1) 45 . V tej študiji smo izbrali slednjo rešitev (sliki 1b in S1). Končno lasersko segrevanje ne zagotavlja enakomerne porazdelitve temperature. Tudi pri enaki jakosti laserskega žarka (slika 1d) porazdelitev temperature ni enakomerna, temveč je zaradi toplotne difuzije podobna Gaussovi porazdelitvi (slika 1e). Kadar je cilj določiti natančne temperature v vidnem polju za preučevanje bioloških sistemov, neenakomerni profili niso idealni in lahko vodijo tudi do termoforetskega gibanja bakterij, če se ne oprimejo substrata (glej sliko S3, S4)39. V ta namen smo uporabili modulator prostorske svetlobe (SLM) za oblikovanje infrardečega laserskega žarka glede na obliko obroča (slika 1f) v ravnini vzorca, da bi dosegli popolnoma enakomerno porazdelitev temperature znotraj danega geometrijskega območja, kljub toplotni difuziji (slika 1d) 39, 42, 46. Zgornje pokrovno stekelec postavite na kovinsko posodo (slika 1b), da preprečite izhlapevanje gojišča, in opazujte vsaj nekaj dni. Ker ta zgornja krovna stekelka ni zapečatena, lahko dodaten medij enostavno dodate kadar koli, če je potrebno.
Za ponazoritev delovanja LA-HTM in prikaz njegove uporabnosti v termofilnih raziskavah smo proučevali aerobne bakterije Geobacillus stearothermophilus, ki imajo optimalno rastno temperaturo okoli 60-65°C. Bakterija ima tudi bičke in sposobnost plavanja, kar je še en pokazatelj normalne celične aktivnosti.
Vzorci (slika 1b) so bili predhodno inkubirani pri 60 °C eno uro in nato postavljeni v držalo za vzorce LA-HTM. Ta predinkubacija je neobvezna, a še vedno uporabna iz dveh razlogov: prvič, ko je laser vklopljen, povzroči takojšnjo rast in delitev celic (glejte film M1 v dodatnem materialu). Brez predinkubacije se rast bakterij običajno upočasni za približno 40 minut vsakič, ko se na vzorcu segreje novo opazovalno območje. Drugič, 1-urna predinkubacija je spodbudila adhezijo bakterij na pokrovno stekelce, kar je preprečilo, da bi celice odplavale iz vidnega polja zaradi termoforeze, ko je bil laser vklopljen (glejte film M2 v dodatnem materialu). Termoforeza je gibanje delcev ali molekul vzdolž temperaturnega gradienta, običajno od vročega do hladnega, in bakterije niso izjema43,47. Ta neželeni učinek se na določenem območju odpravi z uporabo SLM za oblikovanje laserskega žarka in doseganje ravne porazdelitve temperature.
Na sl. Slika 2 prikazuje porazdelitev temperature, izmerjeno s CGM, pridobljeno z obsevanjem steklene podlage, prevlečene z zlatimi nanodelci, z obročastim laserskim žarkom (slika 1f). Opažena je bila ravna porazdelitev temperature po celotnem območju, ki ga pokriva laserski žarek. To območje je bilo nastavljeno na 65 °C, kar je optimalna temperatura rasti. Zunaj tega območja temperaturna krivulja seveda pade na \(1/r\) (kjer je \(r\) radialna koordinata).
temperaturni zemljevid meritev CGM, dobljen z uporabo obročastega laserskega žarka za obsevanje plasti zlatih nanodelcev, da dobimo raven temperaturni profil na krožnem območju. b Izoterma temperaturne karte (a). Kontura laserskega žarka je predstavljena s sivim pikčastim krogom. Poskus je bil ponovljen dvakrat (glej dopolnilni material, slika S4).
Viabilnost bakterijskih celic smo spremljali več ur z uporabo LA-HTM. Na sl. 3 prikazuje časovni interval za štiri slike, posnete iz 3-urnega 20-minutnega filma (film M3, dodatne informacije). Opazili so, da se bakterije aktivno razmnožujejo znotraj krožnega območja, ki ga določa laser, kjer je bila temperatura optimalna in se je približevala 65 °C. V nasprotju s tem se je rast celic znatno zmanjšala, ko je temperatura za 10 s padla pod 50 °C.
Optične globinske slike bakterij G. stearothermophilus, ki rastejo po laserskem segrevanju ob različnih časih, (a) t = 0 min, (b) 1 h 10 min, (c) 2 h 20 min, (d) 3 h 20 min, izven 200 Izvleček iz enominutnega filma (film M3, naveden v dodatnih informacijah), ki je naložen na ustrezno temperaturno karto. Laser se vklopi ob času \(t=0\). Izoterme so bile dodane sliki intenzivnosti.
Za nadaljnjo količinsko opredelitev celične rasti in njene odvisnosti od temperature smo izmerili povečanje biomase različnih kolonij prvotno izoliranih bakterij v vidnem polju Movie M3 (slika 4). Starševske bakterije, izbrane na začetku tvorbe mini kolonije (mCFU), so prikazane na sliki S6. Meritve suhe mase so bile opravljene s kamero CGM 48, ki je bila uporabljena za kartiranje porazdelitve temperature. Sposobnost CGM za merjenje suhe teže in temperature je prednost LA-HTM. Kot je bilo pričakovano, je visoka temperatura povzročila hitrejšo rast bakterij (slika 4a). Kot je prikazano na pollogaritmičnem grafu na sliki 4b, rast pri vseh temperaturah sledi eksponentni rasti, kjer podatki uporabljajo eksponentno funkcijo \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), kjer \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – čas generiranja (ali čas podvojitve), \( g =1/ \tau\) – stopnja rasti (število delitev na časovno enoto). Na sl. 4c prikazuje ustrezno hitrost rasti in čas generiranja kot funkcijo temperature. Za hitro rastoče mCFU je značilna nasičenost rasti po dveh urah, kar je pričakovano vedenje zaradi visoke gostote bakterij (podobno stacionarni fazi v klasičnih tekočih kulturah). Splošna oblika \(g\levo(T\desno)\) (slika 4c) ustreza pričakovani dvofazni krivulji za G. stearothermophilus z optimalno stopnjo rasti okoli 60-65°C. Povežite podatke z uporabo kardinalnega modela (slika S5)49, kjer \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, kar se dobro ujema z drugimi vrednostmi, navedenimi v literaturi49. Čeprav so parametri, odvisni od temperature, ponovljivi, se lahko največja hitrost rasti \({G}_{0}\) razlikuje od enega poskusa do drugega (glejte slike S7-S9 in film M4). V nasprotju s temperaturnimi prilagoditvenimi parametri, ki bi morali biti univerzalni, je največja hitrost rasti odvisna od lastnosti medija (razpoložljivost hranil, koncentracija kisika) znotraj opazovane geometrije mikroskale.
rast mikrobov pri različnih temperaturah. mCFU: Miniaturne enote za tvorbo kolonij. Podatki, pridobljeni iz videa ene same bakterije, ki raste v temperaturnem gradientu (film M3). b Enako kot (a), pollogaritemska lestvica. c Hitrost rasti\(\tau\) in čas generiranja\(g\), izračunana z linearno regresijo (b). Horizontalne vrstice napak: temperaturno območje, v katerem so se mCFU razširile v vidno polje med rastjo. Navpične vrstice napak: standardna napaka linearne regresije.
Poleg normalne rasti so nekatere bakterije med laserskim segrevanjem včasih lebdele v vidnem polju, kar je pričakovano vedenje za bakterije z bički. Film M5 v dodatnih informacijah prikazuje takšne plavalne aktivnosti. V tem poskusu je bilo uporabljeno enotno lasersko sevanje za ustvarjanje temperaturnega gradienta, kot je prikazano na slikah 1d, e in S3. Slika 5 prikazuje dve zaporedji slik, izbrani iz filma M5, ki prikazujeta, da ena bakterija kaže usmerjeno gibanje, medtem ko vse druge bakterije ostanejo nepremične.
Dva časovna okvira (a) in (b) prikazujeta plavanje dveh različnih bakterij, označenih s pikčastimi krogi. Slike so bile izvlečene iz filma M5 (na voljo kot dodatno gradivo).
V primeru G. stearothermophilus se je aktivno gibanje bakterij (slika 5) začelo nekaj sekund po vklopu laserskega žarka. Ta ugotovitev poudarja časovni odziv tega termofilnega mikroorganizma na zvišanje temperature, kot so že opazili Mora et al. 24. Temo bakterijske gibljivosti in celo termotaksije je mogoče nadalje raziskati z uporabo LA-HTM.
Mikrobnega plavanja ne smemo zamenjevati z drugimi vrstami fizičnega gibanja, in sicer (i) Brownovim gibanjem, ki se zdi kaotično gibanje brez določene smeri, (ii) konvekcijo 50 in termoforezo 43, sestavljeno iz pravilnega premika gibanja vzdolž temperature gradient.
G. stearothermophilus je znan po svoji sposobnosti proizvajanja zelo odpornih spor (tvorba trosov), ko je izpostavljen neugodnim okoljskim razmeram kot obramba. Ko okoljske razmere spet postanejo ugodne, spore vzklijejo, tvorijo žive celice in ponovno začnejo rasti. Čeprav je ta proces sporulacije/kalitve dobro znan, ga nikoli niso opazili v realnem času. Z uporabo LA-HTM poročamo o prvem opazovanju dogodkov kalitve pri G. stearothermophilus.
Na sl. Slika 6a prikazuje slike optične globine (OT) v časovnem zamiku, pridobljene z uporabo CGM kompleta 13 spor. V celotnem času zbiranja (15 h 6 min, \(t=0\) – začetek laserskega segrevanja) so vzklile 4 od 13 spor, v zaporednih časovnih točkah \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' in \(11\) h \(30\)'. Čeprav je na sliki 6 prikazan samo eden od teh dogodkov, lahko v filmu M6 v dodatnem gradivu opazimo 4 dogodke kalitve. Zanimivo je, da se zdi, da je kalitev naključna: vse spore ne vzklijejo in ne vzklijejo hkrati, kljub enakim spremembam okoljskih pogojev.
časovni zamik, sestavljen iz 8 OT slik (oljna imerzija, 60x, objektiv 1,25 NA) in (b) razvoj biomase agregatov G. stearothermophilus. c (b) Narisano v pollogaritmičnem merilu, da se poudari linearnost stopnje rasti (črtkana črta).
Na sl. 6b,c prikazuje biomaso celičnih populacij v vidnem polju kot funkcijo časa v celotnem obdobju zbiranja podatkov. Hiter razpad suhe mase, opažen pri \(t=5\)h na sl. 6b, c, zaradi izstopa nekaterih celic iz vidnega polja. Hitrost rasti teh štirih dogodkov je \(0,77\pm 0,1\) h-1. Ta vrednost je višja od stopnje rasti, povezane s sliko 3. 3 in 4, kjer celice rastejo normalno. Razlog za povečano stopnjo rasti G. stearothermophilus iz spor je nejasen, vendar te meritve poudarjajo zanimanje za LA-HTM in delujejo na ravni posamezne celice (ali na ravni posamezne mCFU), da bi izvedeli več o dinamiki celičnega življenja. .
Za nadaljnji prikaz vsestranskosti LA-HTM in njegove učinkovitosti pri visokih temperaturah smo pregledali rast Sulfolobus shibatae, hipertermofilne acidofilne arheje z optimalno rastno temperaturo 80 °C51. V primerjavi z G. stearothermophilus imajo te arheje tudi zelo drugačno morfologijo, ki spominjajo na 1 mikronske kroglice (koke) in ne na podolgovate palice (bacile).
Slika 7a je sestavljena iz zaporednih optičnih globinskih slik S. shibatae mCFU, pridobljenih z uporabo CGM (glejte igrani film M7 v dodatnem materialu). Ta mCFU raste pri približno 73 °C, pod optimalno temperaturo 80 °C, vendar znotraj temperaturnega območja za aktivno rast. Opazili smo večkratne cepitvene dogodke, zaradi katerih so mCFU po nekaj urah izgledale kot mikrogrozdje arhej. Iz teh slik OT je bila biomasa mCFU izmerjena skozi čas in predstavljena na sliki 7b. Zanimivo je, da so mCFU-ji S. shibatae pokazali linearno rast namesto eksponentne rasti, opažene pri mCFU-jih G. stearothermophilus. Obstaja dolgotrajna razprava 52 o naravi stopenj rasti celic: medtem ko nekatere študije poročajo o stopnjah rasti mikrobov, ki so sorazmerne z njihovo velikostjo (eksponentna rast), druge kažejo konstantno hitrost (linearna ali bilinearna rast). Kot so razložili Tzur et al.53, je za razlikovanje med eksponentno in (bi)linearno rastjo potrebna natančnost <6 % pri meritvah biomase, kar je nedosegljivo za večino tehnik QPM, tudi če vključuje interferometrijo. Kot so razložili Tzur et al.53, je za razlikovanje med eksponentno in (bi)linearno rastjo potrebna natančnost <6 % pri meritvah biomase, kar je nedosegljivo za večino tehnik QPM, tudi če vključuje interferometrijo. Kot so razložili Cur in dr.53, različna eksponentna in (bi)linearna rast zahteva natančnost <6% v meritvah biomase, kar je nedosegljivo za večino metod QPM, tudi z uporabo interferometrije. Kot pojasnjujejo Zur et al.53, razlikovanje med eksponentno in (bi)linearno rastjo zahteva <6 % natančnost pri meritvah biomase, kar je nedosegljivo za večino metod QPM, tudi z uporabo interferometrije.Kot pojasnjujejo Zur et al. 53, razlikovanje med eksponentno in (bi)linearno rastjo zahteva manj kot 6% natančnost pri meritvah biomase, kar je nedosegljivo za večino metod QPM, tudi če se uporablja interferometrija. CGM doseže to natančnost s sub-pg natančnostjo pri meritvah biomase36,48.
časovni zamik, sestavljen iz 6 OT slik (potopitev v olje, 60x, objektiv NA 1,25) in (b) razvoj biomase mikro-CFU, izmerjen s CGM. Za več informacij si oglejte film M7.
Popolnoma linearna rast S. shibatae je bila nepričakovana in o njej še niso poročali. Pričakuje pa se eksponentna rast, vsaj zato, ker se sčasoma mora zgoditi večkratna delitev 2, 4, 8, 16 … celic. Domnevali smo, da je lahko linearna rast posledica zaviranja celic zaradi gostega pakiranja celic, tako kot se rast celic upočasni in sčasoma doseže stanje mirovanja, ko je gostota celic previsoka.
Zaključimo z razpravo o naslednjih petih zanimivostih: zmanjšanje prostornine segrevanja, zmanjšanje toplotne vztrajnosti, zanimanje za nanodelce zlata, zanimanje za kvantitativno fazno mikroskopijo in možno temperaturno območje, v katerem se lahko uporablja LA-HTM.
V primerjavi z uporovnim ogrevanjem ponuja lasersko ogrevanje, ki se uporablja za razvoj HTM, več prednosti, ki jih ponazarjamo v tej študiji. Zlasti v tekočem mediju v vidnem polju mikroskopa se segrevalni volumen ohranja znotraj nekaj (10 μm) 3 volumnov. Na ta način so aktivni samo opazovani mikrobi, medtem ko so druge bakterije v mirovanju in jih je mogoče uporabiti za nadaljnje preučevanje vzorca – vzorca ni treba menjati vsakič, ko je treba preveriti novo temperaturo. Poleg tega ogrevanje v mikroskopskem merilu omogoča neposredno preiskavo širokega razpona temperatur: slika 4c je bila pridobljena iz 3-urnega filma (film M3), ki običajno zahteva pripravo in preiskavo več vzorcev – enega za vsakega od proučevanih vzorcev. y je temperatura, ki predstavlja število dni v poskusu. Zmanjšanje ogrevane prostornine ohranja tudi vse okoliške optične komponente mikroskopa, zlasti lečo objektiva, na sobni temperaturi, kar je bila doslej velika težava, s katero se je soočala skupnost. LA-HTM se lahko uporablja s katero koli lečo, vključno z oljnimi imersijskimi lečami, in bo ostal pri sobni temperaturi tudi pri ekstremnih temperaturah v vidnem polju. Glavna omejitev metode laserskega segrevanja, o kateri poročamo v tej študiji, je, da so lahko celice, ki se ne držijo ali lebdijo, daleč od vidnega polja in jih je težko preučevati. Rešitev bi lahko bila uporaba leč z majhno povečavo, da bi dosegli večji dvig temperature, ki presega nekaj sto mikronov. To previdnost spremlja zmanjšanje prostorske ločljivosti, če pa je cilj proučevanje gibanja mikroorganizmov, visoka prostorska ločljivost ni potrebna.
Časovna lestvica za ogrevanje (in hlajenje) sistema \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) je odvisna od njegove velikosti, po zakonu \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), kjer \ (L\ ) je značilna velikost vira toplote (premer laserskega žarka v naši raziskavi je \(L\ približno 100\) μm), \(D\) je toplotna difuzivnost okolja (povprečje v naši ohišje, steklo in voda Hitrost difuzije\(D\ približno 2\krat {10}^{-7}\) m2/s Zato so v tej študiji časovni odzivi reda 50 ms, tj. kvazitrenutni). Ta trenutna vzpostavitev dviga temperature ne le skrajša trajanje poskusa, ampak omogoča tudi natančno časovno razporeditev \(t=0\) za vsako dinamično študijo temperaturnih učinkov.
Predlagana metoda je uporabna za vse podlage, ki absorbirajo svetlobo (na primer komercialne vzorce z ITO prevleko). Vendar pa lahko zlati nanodelci zagotovijo visoko absorpcijo v infrardečem in nizko absorpcijo v vidnem območju, pri čemer so slednje značilnosti zanimive za učinkovito optično opazovanje v vidnem območju, zlasti pri uporabi fluorescence. Poleg tega je zlato biokompatibilno, kemično inertno, optično gostoto je mogoče nastaviti od 530 nm do bližnje infrardeče, priprava vzorca pa je preprosta in ekonomična29.
Mikroskopija valovne fronte s prečno rešetko (CGM) omogoča ne le kartiranje temperature na mikroskali, temveč tudi spremljanje biomase, zaradi česar je še posebej uporabna (če ni potrebna) v kombinaciji z LA-HTM. V zadnjem desetletju so bile razvite druge tehnike temperaturne mikroskopije, zlasti na področju bioimaginga, in večina jih zahteva uporabo temperaturno občutljivih fluorescenčnih sond 54, 55. Vendar so bile te metode kritizirane in nekatera poročila so izmerila nerealne temperaturne spremembe v celicah, verjetno zaradi dejstva, da je fluorescenca odvisna od mnogih dejavnikov, ki niso temperatura. Poleg tega je večina fluorescenčnih sond nestabilnih pri visokih temperaturah. Zato QPM in zlasti CGM predstavljata idealno tehniko temperaturne mikroskopije za preučevanje življenja pri visokih temperaturah z optično mikroskopijo.
Študije S. shibatae, ki živijo optimalno pri 80 °C, kažejo, da se lahko LA-HTM uporabi za preučevanje hipertermofilov, ne le preprostih termofilov. Načeloma ni omejitev za razpon temperatur, ki jih je mogoče doseči z uporabo LA-HTM, in celo temperature nad 100 °C je mogoče doseči pri atmosferskem tlaku brez vrenja, kot je pokazala naša skupina 38 v aplikacijah hidrotermalne kemije pri atmosferskem tlak A. Laser se uporablja za segrevanje zlatih nanodelcev 40 na enak način. Tako ima LA-HTM možnost uporabe za opazovanje hipertermofilov brez primere s standardno optično mikroskopijo visoke ločljivosti pod standardnimi pogoji (tj. pod okoljskim stresom).
Vsi poskusi so bili izvedeni z domačim mikroskopom, vključno s Köhlerjevo osvetlitvijo (z LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), držalom za vzorce z ročnim premikanjem xy, objektivi (Olympus, 60x, 0,7 NA, zrak, LUCPlanFLN60X ali 60x, 1,25 NA, olje , UPLFLN60XOI), kamero CGM (navzkrižna rešetka QLSI, korak 39 µm, 0,87 mm od senzorja kamere Andor Zyla) za zagotavljanje intenzivnosti in slikanja valovne fronte ter kamero sCMOS (ORCA Flash 4.0 V3, 16-bitni način, proizvajalec Hamamatsu) za snemanje podatki prikazani na sliki 5 (bakterijsko plavanje). Dihroični cepilnik žarka je 749 nm BrightLine edge (Semrock, FF749-SDi01). Filter na sprednji strani kamere je kratkoprepustni filter 694 (FF02-694/SP-25, Semrock). Laser s titanovim safirjem (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, črpalna laserska votlina cunamija, Spectra-Physics na sliki 2-5, nadalje nadomeščen z laserjem Millenia, Spectraphysics 10 W, črpalna laserska votlina Mira, Coherent, za sliko 2 -5). 6 in 7) so nastavljene na valovno dolžino \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, ki ustreza spektru plazmonske resonance zlatih nanodelcev. Modulatorji prostorske svetlobe (1920 × 1152 pikslov) so bili kupljeni pri Meadowlark Optics, izračunani z algoritmom Gerchberg-Saxton, kot je opisano v povezavi.
Cross grating wavefront microscopy (CGM) je tehnika optične mikroskopije, ki temelji na kombinaciji dvodimenzionalne uklonske mreže (znane tudi kot navzkrižna rešetka) na razdalji enega milimetra od senzorja običajne kamere. Najpogostejši primer CGM, ki smo ga uporabili v tej študiji, se imenuje interferometer s prečnim premikom štirih valovnih dolžin (QLSI), kjer je navzkrižna rešetka sestavljena iz vzorca šahovnice intenzivnosti/faze, ki so ga uvedli in patentirali Primot et al. leta 200034. Navpične in vodoravne mrežne črte ustvarjajo mrežaste sence na senzorju, katerih popačenje je mogoče numerično obdelati v realnem času, da se pridobi optično popačenje valovne fronte (ali enakovredni fazni profil) vpadne svetlobe. Pri uporabi na mikroskopu lahko kamera CGM prikaže razliko optične poti posnetega predmeta, znano tudi kot optična globina (OT), z občutljivostjo reda nanometrov36. Pri kateri koli meritvi CGM je treba za odpravo morebitnih napak v optičnih komponentah ali žarkih vzeti primarno referenčno OT sliko in jo odšteti od vseh naslednjih slik.
Temperaturno mikroskopijo smo izvedli s kamero CGM, kot je opisano v referenci. 32. Skratka, segrevanje tekočine spremeni njen lomni količnik in ustvari učinek toplotne leče, ki popači vpadni žarek. To popačenje valovne fronte izmeri CGM in obdela z algoritmom dekonvolucije, da dobimo tridimenzionalno porazdelitev temperature v tekočem mediju. Če so nanodelci zlata enakomerno porazdeljeni po celotnem vzorcu, se lahko kartiranje temperature izvede na območjih brez bakterij, da se ustvarijo boljše slike, kar včasih počnemo. Referenčna slika CGM je bila pridobljena brez ogrevanja (z izklopljenim laserjem) in nato zajeta na istem mestu na sliki z vklopljenim laserjem.
Merjenje suhe mase se izvede z isto kamero CGM, ki se uporablja za temperaturno slikanje. Referenčne slike CGM so bile pridobljene s hitrim premikanjem vzorca v x in y med izpostavljenostjo kot sredstvo za povprečenje kakršne koli nehomogenosti v OT zaradi prisotnosti bakterij. Iz OT slik bakterij je bila njihova biomasa pridobljena z uporabo niza slik na območjih, izbranih z Matlabovim domačim algoritmom segmentacije (glejte pododdelek »Numerična koda«), po postopku, opisanem v ref. 48. Na kratko, uporabljamo relacijo \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), kjer je \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) slika optične globine, \(m\) suha teža in \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) je konstanta. Izbrali smo \({{{{\rm{\alpha))))))=0,18\) µm3/pg, kar je tipična konstanta za žive celice.
Pokrivno stekelce s premerom 25 mm in debelino 150 µm, prevlečeno z nanodelci zlata, je bilo postavljeno v komoro AttofluorTM (Thermofisher) z nanodelci zlata obrnjenimi navzgor. Geobacillus stearothermophilus smo pred vsakim dnem poskusov gojili preko noči v mediju LB (200 vrt/min, 60 °C). Kapljico 5 µl suspenzije G. stearothermophilus z optično gostoto (OD) 0,3 do 0,5 smo nanesli na pokrovno stekelce z nanodelci zlata. Nato smo na kapljico kapnili okroglo pokrovno stekelce premera 18 mm z luknjico premera 5 mm v sredini in na sredino luknjice večkrat nanesli 5 μl bakterijske suspenzije z enako optično gostoto. Jamice na pokrovnih stekelcih so bile pripravljene v skladu s postopkom, opisanim v ref. 45 (za več informacij glejte Dodatne informacije). Nato na pokrovno stekelec dodajte 1 ml medija LB, da preprečite izsušitev tekoče plasti. Zadnje pokrovno stekelec postavite na zaprt pokrov komore Attofluor™, da preprečite izhlapevanje gojišča med inkubacijo. Za poskuse kaljenja smo uporabili trose, ki so po običajnih poskusih včasih prekrili vrhnjo pokrovnico. Podobno metodo smo uporabili za pridobivanje Sulfolobus shibatae. Tri dni (200 obratov na minuto, 75 °C) predhodne kultivacije Thiobacillus serrata smo izvedli v mediju 182 (DSMZ).
Vzorce nanodelcev zlata smo pripravili z micelarno blok kopolimerno litografijo. Ta postopek je podrobno opisan v pogl. 60. Na kratko, micele, ki inkapsulirajo zlate ione, smo sintetizirali z mešanjem kopolimera s HAuCl4 v toluenu. Očiščena pokrovna stekelca smo nato potopili v raztopino in obdelali z UV obsevanjem v prisotnosti redukcijskega sredstva, da smo dobili zlata semena. Končno so bila zlata semena vzgojena tako, da so pokrovno stekelce 16 minut kontaktirali z vodno raztopino KAuCl4 in etanolamina, kar je povzročilo kvaziperiodično in zelo enakomerno razporeditev nesferičnih zlatih nanodelcev v bližnjem infrardečem sevanju.
Za pretvorbo interferogramov v OT slike smo uporabili domači algoritem, kot je podrobno opisano v povezavi. 33 in je na voljo kot paket Matlab v naslednjem javnem repozitoriju: https://github.com/baffou/CGMprocess. Paket lahko izračuna intenzivnost in OT slike na podlagi posnetih interferogramov (vključno z referenčnimi slikami) in razdalj niza kamer.
Za izračun faznega vzorca, uporabljenega za SLM za pridobitev danega temperaturnega profila, smo uporabili predhodno razvit domač algoritem39, 42, ki je na voljo v naslednjem javnem skladišču: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Vhod je želeno temperaturno polje, ki ga lahko nastavimo digitalno ali preko enobarvne bmp slike.
Za segmentacijo celic in merjenje njihove suhe teže smo uporabili naš algoritem Matlab, objavljen v naslednjem javnem repozitoriju: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Na vsaki sliki mora uporabnik klikniti bakterijo ali mCFU, ki ga zanima, prilagoditi občutljivost palice in potrditi izbiro.
Za več informacij o zasnovi študije glejte povzetek Nature Research Report, ki je povezan s tem člankom.
Podatki, ki podpirajo rezultate te študije, so na voljo pri ustreznih avtorjih na razumno zahtevo.
Izvorna koda, uporabljena v tej študiji, je podrobno opisana v razdelku Metode, različice za odpravljanje napak pa je mogoče prenesti s https://github.com/baffou/ v naslednjih repozitorijih: SLM_temperatureShaping, CGMprocess in CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Vpogled v termofile in njihove široke spektralne uporabe. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Vpogled v termofile in njihove široke spektralne uporabe.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. in Sharma, AK Pregled termofilov in njihove široke uporabe. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. in Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. in Sharma AK Globoko razumevanje termofilov in širok spekter uporabe.3 Biotehnologija 6, 81 (2016).
Čas objave: 26. september 2022